瞬时受体电位通道(transient receptor potential，TRP)是一类广泛分布于多细胞生物机体外周和中枢神经系统的非选择性阳离子通道[1-2]。瞬时受体电位香草酸受体亚型1(transient receptor potential vanilloid receptor subtype1，TRPV1)是TRP通道家族成员之一，可被热(>43℃)、化学成分、低pH ( < 5.9)等激活，主要表达于背根神经节(DRG)等外周感觉神经元中，与机体感知外环境温度进而调节机体的能量代谢过程关系密切[3-5]。以往研究TRPV1通道的温觉感知功能，主要以共聚焦或膜片钳为研究平台，采用辣椒素等受体激动剂代替热刺激激活TRPV1通道的模式，评价TRPV1通道介导温觉刺激的生物功能[6-7]。由于化学成分与温度刺激激活TRPV1的位点并不一致[8-9]，它们所传递的生物学意义也不尽相同。因此，本研究利用7900PCR仪的自动升温功能和先进的荧光检测系统，尝试基于PCR仪搭建TRPV1通道的检测和分析平台，在评测体系建立的基础上，选用临床常用的热性中药的主要活性成分进行测试研究，为科学揭示中药寒热属性的生物学基础和现代科学内涵积累有效数据。
1 仪器及材料7900HT型荧光定量PCR仪(ABI公司)；FA1004N电子分析天平(上海精密仪器仪表有限公司)。二甲基亚砜(国药集团化学试剂有限公司，批号：30072492)；无水乙醇(北京化工厂，批号：30072492)；Fluo-4 AM(Life technologies，批号：1321009)；F-127(Invitrgen，批号：980247)。辣椒素(Fluka，批号：BCBM1193，纯度≥99%)；胡椒碱(西安冠宇生物技术有限公司，批号：20160308，纯度≥98%)；阿魏酸(批号：PS01910100，纯度98.5%)和姜黄素(批号：PS09112601，纯度99.5%)均购于成都普斯生物科技股份有限公司；乌头碱(宝鸡市辰光生物科技有限公司，批号：20131016，纯度≥98%)；欧前胡素(批号：140511)、异欧前胡素(批号：140608)、高良姜素(批号：141028)、三七皂苷R1(批号：140328)、吴茱萸碱(批号：140526)和桂皮醛(批号：140518，纯度≥97%)均购于成都克洛玛生物科技有限公司(纯度≥98%，除桂皮醛)；辣椒平(宁波智锐新材料有限公司，纯度≥99%)。
2 方法 2.1 背根神经节(DRG)神经元的分离与培养小鼠置于75%乙醇中消毒后，剖开背部皮肤，露出脊椎。将颈椎部分剪断，从颈椎纵向向下剪断脊椎两边的肋骨，取出脊椎并修剪。从背侧用眼科剪分别从左右两侧将髓腔打开，在解剖显微镜下将脊椎内两侧的背根神经节取出，剪掉神经根及胞膜，置于4°C的L15培养基中。将取出的背根神经节用吸管移到离心管内，静置1 min，将离心管内的L15吸出，加入1 g·L-1胶原酶于37℃消化15 min。再将胶原酶移出，加入0.25%胰蛋白酶于37℃消化30 min，每5 min轻轻吹打一次，加入含10% FBS的L15终止消化，1 000 r·min-1离心5 min。弃废液后用Neurobasal培养基重悬细胞，过80目筛，细胞接种于预先包被多聚赖氨酸的6孔板中，在37℃、5% CO2条件下培养48 h后更换培养液。
2.2 PCR检测平台功能的鉴定将培养板中的背根神经节细胞以1×105个/孔的密度铺于预先包被多聚赖氨酸的96孔反应板中，培养24 h。将板内细胞用PBS洗2遍，加入终浓度为4 μmol·L-1的Fluo-4 AM工作液，37℃孵育30 min。将板内荧光染料轻轻吸出，用PBS洗2遍。每孔加入45 μL Hank’s液，实验组加入5 μL相应浓度的阻断剂，对照组加入5 μL Hank’s液。将板用膜封好。打开7900HT型荧光定量PCR仪SDS2.4软件，进行PCR检测平台反应条件设置，设置条件见Tab 1。
| TRPV1(elevated temperature) | |
| Temperature setting | 37℃、40℃、43℃、46℃、49℃、52℃、55℃、58℃、61℃ |
| Time setting | 2 min、90 s、90 s、90 s、90 s、90 s、90 s、90 s、90 s |
| Blocking agent |
Capsazepine(1 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol· L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1) |
| Experimental data converted to change rate of fluorecence value(ΔF/F0) | |
将培养板中的背根神经节细胞以1× 105个/孔的密度铺于预先包被多聚赖氨酸的96孔反应板中，培养24 h。将板内细胞用PBS洗2遍，加入终浓度为4 μmol·L-1的Fluo-4 AM工作液，37℃孵育30 min。将板内荧光染料轻轻吸出，用PBS洗2遍。每孔加入45 μL Hank’s液，实验组加入5 μL 200 μmol·L-1浓度的热性中药成分，对照组加入5 μL不含中药成分的溶剂，用膜封好96孔板。打开7900 HT型荧光定量PCR仪SDS 2.4软件，进行PCR检测平台反应条件设置，设置条件和分析方法同上。
2.4 统计分析实验数据以x±s表示，使用SPSS 15.0统计软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间采用t检验。
3 结果 3.1 PCR检测平台功能的鉴定结果由Fig 1知，原代培养的背根神经节细胞经温度激活(37℃到61℃)达到43℃时，荧光值开始升高，在49℃时荧光值达到最高。给予10μmol·L-1的辣椒平后，43℃左右荧光值未升高，TRPV1通道被辣椒平阻断。如Fig 2所示，随着辣椒平浓度的升高，背根神经节的TRPV1通道功能逐渐降低。由Tab 2知，1 μmol·L-1、5 μmol·L-1辣椒平与对照组相比差异明显(P < 0.05)，10、50、100、200 μmol·L-1辣椒平与对照组相比差异有显著性(P < 0.01)。
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| Fig 1 Temperature actiation of TRPV1 in DRG neurons |
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| Fig 2 Inhibition on TRPV1 in DRG neurons by different concentrations of capsazepine |
| Group | Channel function(ΔF/F 0×100%) | |
| Control | 22.76±0.01 | |
| capsazepine | 1 μmol·L -1 | 14.95±0.06 |
| 5 μmol·L -1 | 9.35±0.04 | |
| 10 μmol·L -1 | 1.53±0.01 ** | |
| 50 μmol·L -1 | 1.32±0.03 ** | |
| 100 μmol·L -1 | 0.55±0.01 ** | |
| 200 μmol·L -1 | 0.41±0.02 ** | |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control | ||
PCR检测平台考察了20 μmol·L-1浓度的热性中药成分对背根神经节TRPV1通道的影响。鉴于TRPV1通道在温度>43℃时被激活，因此在数据采集时我们选用该通道被激活后的荧光变化值作为统计源数据。因中药成分较多，分成了两部分检测，Fig 3和Tab 3为第一部分，Fig 4和Tab 4为第二部分。由Fig 3、Tab 3可知，与对照组相比，阿魏酸对TRPV1通道功能的上调作用明显(P < 0.05)，辣椒碱、吴茱萸碱、胡椒碱、乌头碱、姜黄素对TRPV1通道功能的上调作用非常明显(P < 0.01)。由Fig 4、Tab 4可知，与对照组相比，桂皮醛对TRPV1通道功能的上调作用明显(P < 0.05)。
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| Fig 3 Effect of ingredients from hot herbs on TRPV1 channel activation at 43℃ A:Control; B:Capsaicin; C:Evodiamine; D:Piperine; E:Aconitine; F:Curcumin; G:Ferulic acid |
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| Fig 4 Effect of ingredients from hot herbs on TRPV1 channel activation at 43℃ A:Control; B:Galangin; C:Imperatorin; D:Isoimperatorin; E:Notoginsenoside; F: Cinnamaldehyde |
| Group | Concentration/μmol·L -1 | ΔF/F 0/% control |
| Control | - | 100.00±16.99 |
| Capsaicin | 20 | 202.31±16.72 ** |
| Evodiamine | 20 | 168.58±29.42 ** |
| Piperine | 20 | 121.50±7.02 ** |
| Aconitine | 20 | 205.56±25.95 ** |
| Curcumin | 20 | 155.76±19.87 ** |
| Ferulic acid | 20 | 134.14±20.85 |
| *P < 0.05;**P < 0.01 vs control | ||
| Group | Concentration/μmol·L -1 | ΔF/F 0/% control |
| Control | - | 100.00±16.06 |
| Galangin | 20 | 92.16±12.42 |
| Imperatorin | 20 | 83.97±27.16 |
| Isoimperatorin | 20 | 107.10±17.93 |
| Notoginsenoside | 20 | 98.17±14.59 |
| Cinnamaldehyde | 20 | 127.76±7.14 |
| *P < 0.05 vs control | ||
本研究利用新型荧光定量PCR具有自动升温和荧光信号捕获的功能，尝试基于7900HT型荧光定量PCR仪构建了PCR检测平台，首先以背根神经节原代神经元为检测体系，通过升温变化激活TRPV1通道，检测Ca2+通过TRPV1通道进入胞内所引起的荧光值变化，并用阻断剂对PCR检测平台的功能加以验证。研究结果显示[13]，温度升高约43℃以上时，胞内的荧光值逐渐开始升高，提示Ca2+通道被打开，进入胞内的Ca2+与预先孵育时进入的荧光指示剂结合产生荧光。与对照组比较，1 μmol·L-1辣椒平对TRPV1通道功能具有明显的抑制作用，浓度越高，抑制作用越强，存在良好的浓度依赖关系，这些现象表明，仪器检测到的荧光值的变化是由TRPV1通道受温度激活后被打开引起的，也反映了基于PCR仪的TRPV1通道功能良好，适于药物调节TRPV1通道功能的评价和研究。
研究显示[10-12]，大部分(除高良姜素、欧前胡素、三七皂苷)经过热性中药成分对TRPV1通道的Ca2+介导功能具有一定的促进作用。除高良姜素、欧前胡素、异欧前胡素、三七皂苷外，其它所选成分与对照组相比，均有明显差异。联系我们以往的研究结果，部分热性中药成分能够提高动物机体能量代谢过程，有理由认为，热性中药表征的热性属性与其所含的活性成分能够提高TRPV1通道感知温度的活性，从而增加机体的能量代谢有关。但鉴于本研究只测试和分析了中药的单一成分，在TRPV1通道环节上，这些成分多大程度上能够代表中药整体的活性调节作用尚有待进一步结合其所源中药的其它成分进行深入研究和综合分析。
( 致谢: 本实验在中国中医科学院中药研究所中药理论与本草文献研究中心实验室由周海玉、戴丽、王德凤、戴逸飞、周炜炜、孟晶、隋峰、霍海如等共同参与完成的。 )
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