马桑(coriaria sinica maxim)系木兰亚纲马桑科(coriariaceae)马桑属(coriaria linn)多年生落叶小乔木，其主要成分为马桑内酯(coriria lactone)、马桑亭(coriatin)、羟基马桑内酯(tutin)等，全株均有毒^[1]。有报道，马桑水提取物和醇提取物对多种细菌和真菌有明显抑制作用^[2]。我们既往研究证实^[3]，马桑水提取物有促进烧伤创面愈合作用。由于烧伤创面愈合的进度和瘢痕过度增生与创面感染密切相关，而随着大量抗生素的应用，目前烧伤创面耐药感染菌的出现，就成为烧伤治疗的一大难题。据此，我们推测民间外用马桑水提取物治疗感染、烧伤、创面经久不愈以及头癣等^[2-3]的机制，很可能与其抗耐药菌作用密切相关。因此，研究了马桑水提取物对烧伤创面感染常见3种耐药菌的抑制作用。现报道如下。

两年生新鲜马桑原生植物枝条，九月采集，经植物学家鉴别晾干备用。取1 kg马桑粉末作为提取样品，将样品用1 000 mL蒸馏水浸泡30 min后，煎煮90 min分别提取3次，将3次提取物合并、过滤和水浴锅浓缩成浸膏(1 mL相当于10 g生药)备用^[3]。

金黄色葡萄球菌ATCC29213(耐药菌，MRSA)/25923(敏感菌)，铜绿假单胞菌ATCC27853(耐药菌，RPA)/15442(敏感菌)，大肠埃希菌ATCC25922(耐药菌，RECO)/35218(敏感菌)均购于南京便诊生物科技有限公司。

MH琼脂(P0226)及肉汤购自上海泛柯生物北京分公司(OXOID公司，UK)，LB琼脂及肉汤购自上海川翔生物科技有限公司；羧苄西林、头孢唑啉、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、红霉素、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、呋喃西林均购自中国药品生物制品检定所；磺胺嘧啶银(Sulfamethazine Silver, SM2-Ag)购自东北制药总生产；DYY-Ⅲ5型稳压流电泳仪(北京六一仪器厂)；麦康凯血平板由重庆市庞通科贸有限公司提供。恒温孵育箱购自德国Queue公司。SW-CJ-4超净工作台由南京莱步科技实业有限公司提供；普通离心机购于北京医药仪器厂；VITEK-60AMS全自动微生物分析系统由法国生物-梅里埃公司提供；2700型PCR仪(美国ABI公司)，Taq PCR Master Mix试剂盒KT-201购自北京百泰克生物技术有限公司；DNA Marker DL 100与2000 bp DNA Ladder购于上海易利生物科技有限公司；PCR引物由北京群晓科苑生物技术有限公司提供；数字化凝胶成像分析仪(Bio-Rad公司)。

配制药物原浓度逐个用无菌蒸馏水2倍稀释配制各种待测药物^[4]。各取已稀释的抗菌液2 mL，加入已标记的系列平板内(内径90 mm)，再加入MH琼脂18 mL(先将琼脂融化，于50℃水浴平衡30 min)，边加边摇晃，混匀药物与培养基，配制得含药琼脂^[5]。配制好不同浓度CSME后，以0.22滤膜过滤除菌，分别于5 mL肉汤液体培养基中加入1 mL不同浓度的CSME和100 μL耐药指示菌配制成菌悬液(菌龄24~48 h，0.5麦氏单位，约10¹¹ CFU·L^-1)，混均，经24 h培养后(37℃)，将灭菌生理盐水1 mL与肉汤液体培养基5 mL的混合液作为空白调零。分别测定570 nm处的吸光值(A)，各测定3次。计算抑菌率。计算方法如下：

(1)

菌株经MH琼脂平板过夜培养后，分别以接种环挑取单个耐药金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)、耐药铜绿假单胞菌(resistant pseudomonas aeruginosa，RPA)以及耐药大肠埃希菌(resistant escherichia coli，RECO)菌落，于2 mL MH肉汤接种，恒温培养箱培养48 h(35℃)。按基因组抽提试剂盒说明书提取基因组DNA，即：取菌液2 mL，离心1 min(100 00 r·min^-1)，弃上清液。加缓冲液180 μL(含20 g·L^-1溶菌酶和0.1 g·L^-1溶葡萄球菌酶)孵育40 min(37℃)后，加蛋白酶K 20 μL，混匀。加GB缓冲液220 μL振荡15 s，恒温10 min(70℃)，待溶液澄清后，离心(去管盖内壁水珠)，加无水乙醇220 μL，混匀，将所得管内液体加入吸附柱置于收集管，以13 400×g离心30 s，弃废液，将吸附柱重新置于收集管。再将GD缓冲液500 μL加入吸附柱中，离心30 s，弃废液后，再将吸附柱置入收集管。将PW缓冲液700 μL加入吸附柱中，离心30 s，弃废液，又置吸附柱于收集管中。将PW缓冲液500 μL加入吸附柱中，离心30 s，去废液，又置吸附柱于收集管中。离心2 min，去废液，将吸附柱室温5 min(去除残余漂洗液)。将吸附柱转入1.5 mL离心管，于吸附膜中央滴加TE洗脱缓冲液50 μL，室温静置5 min，离心2 min。分别得MRSA、RPA和RECO耐药基因组DNA，于-40℃冰箱保存备用。其基因引物见Tab 1。

反应条件：预变性2 min(93℃)，30 s(93℃)，30 s(55℃)，30 s(72℃)，共35个循环。反应体系9.5 μL的ddH₂O，12.5 μL的2×Taq PCR Master Mix，1.0 μL的DNA模板，各1.0 μL上下游引物。其产物于琼脂糖凝胶(质量浓度为15 g·L^-1)电泳30 min，EB染色。MRSA阳性菌株为313 bp DNA电泳条带。

为检查测试菌的存活状态，选择接种平板顺序是低浓度药物平板、高浓度药物平板和不含药物对照平板。各菌样接种菌量为1～2 μL(约含10⁴个菌)。将接种菌液的平板(内径90 mm)置于35℃孵育过夜。从各供试菌斜面上取一环分别放入含无菌水5 mL的试管中混匀，再取供试菌悬液0.1 mL分别均匀涂于含培养基的平板上，各取CSME 2 g稀释5倍，分别将灭菌小圆滤纸片(直径5 mm)浸入不同浓度的药物溶液中(以生理盐水、体积分数0.75乙醇作对照组)，将滤纸片贴于涂有供试菌平板上。对不同供试菌按相应温度培养24～120 h后^[7]，观察各自的抑菌效果。

取按相应时间培养的不同菌液200 μL均匀涂布于无菌培养皿，分别将用抗生素或CSME(初始浓度1.0 g·L^-1)浸湿的滤纸片置入培养皿中，以蒸馏水为对照组，适温培养48 h，观测抑菌圈大小，共重复3次。取对数生长期的相应菌液1 mL加入琼脂上层培养基(质量浓度为4 g·L^-1)试管中，混均后倒入含底层培养基培养皿中，冷凝后于每个培养皿中再放入3个灭菌牛津杯。按美国CLSI2009琼脂二倍稀释法(agar dilutionmethod)药敏试验进行^[8]，测定CSME对各菌株的MIC。用多点接种仪(Denly-A400，接种针直径3 mm)接种于已制备的药敏平皿上(每点菌量10⁴ CFU)，对不同供试菌按相应温度培养24～120 h后，按CLSI标准判断观察结果。CSME的MIC定为完全抑制菌落生长的最低药物浓度(忽略单一生长菌落)。

按文献^[9]光密度法测定CSME抑菌率。各自于肉汤液体培养基(5 mL)中加入相应浓度CSME液(药物组)，随之于上述溶液中加入100 μL指示菌(MRSA、RPA和RECO浓度10¹⁰ CFU·L^-1，菌龄18~24 h)，混均。另外，于肉汤液体培养基(5 mL中加入1 mL灭菌生理盐水混均作为空白调零。各个样品于37℃培养箱培养24 h后，测定吸光值(波长570 nm)，各样品重复测定3次，计算各自抑菌率。

用SPSS12.0软件处理实验数据，数据以x±s表示，统计计算以方差分析，归因误检验用纽曼-科伊尔斯检验，显著性差异定为P < 0.05。

以Harmony 20为MRSA、RPA和RECO阳性菌株，确定质控菌ATCC29213和ATCC27853的耐药基因分别为mecA和mexB，ATCC25922的耐药基因为merA、qacE△1-sull、tnpU和tnpA。检测出这些基因即定为耐药阳性。ATCC25923的mecA基因阴性，ATCC15442的mexB基因阴性，ATCC35218的merA、qacE△1-sull、tnpU和tnpA基因阴性。结果MRSA为92株菌株，RPA为26株菌株，RECO为20株，分别对14种常用抗生素全部耐药。MRSA、RPA及RECO部分菌株耐药基因PCR产物扩增电泳结果见Fig 1。

Fig 1 Identification results on three kinds of drug-resistant strains 1:The mecA gene of MRSA strians; 2:The mexB gene of RPA strians; 3:The merA gene of RECO strians; 4:The qacE△1-sull gene of RECO strians; 5:The tnpA gene of RECO strians; 6:The tnpU gene of RECO strians A:The resistance gene of positive strains, Harmony 20;B:DNA marker DL 2000;C:16SrDNA fragments; D:Negative control; E:The resistance genes of isolating strains

图选项

结果显示，CSME对MESA、RPA和RECO的MIC分别为62.5、125、250(g·L^-1)。随着CSME浓度的增加，AR也相应增加，最终均超过90%。其中，各个不同浓度CSME对RECOA的RA明显低于MRSA和RPA(P < 0.05)。表明CSME对RECO抑制作用弱于其他两种耐药菌。见Tab 2。

在MIC时，91株MRSA对于抗生素耐药率(resistance rate，RR)均在60%～80％，对于羧苄西林、头孢唑林、红霉素等的RR为100%，明显高于CSME(P < 0.05)；CSME对MRSA的抑菌圈(inhibition zone，IZ)明显小于头孢曲松、头孢吡肟、亚胺培南，而大于其他抗生素(P < 0.05)；CSME对RPA的抑菌圈明显小于羧苄西林而大于其他抗生素(P < 0.05)；CSME对RECO的抑菌圈明显小于头孢曲松、头孢吡肟、亚胺培南、环丙沙星、呋喃西林，而大于其他抗生素(P < 0.05)。见Tab 3。

结果显示，随着浓度的增加，CSME对3种耐药菌株的抑制作用逐渐增强，而且对于MRSA的敏感性强于其他耐药菌，浓度在128 g·L^-1时，敏感性就达100%；CSME对RECO的SR均明显低于MRSA和RPA(P < 0.05)，浓度低于4.0 g·L^-1时，几乎没有抑制作用。见Tab 4。

结果显示，在培养时间4 h后，空白对照组的吸光值明显高于羧苄西林组，而羧苄西林组又明显高于CSME组(P < 0.05)，表明空白对照组和羧苄西林组在培养4 h后，MRSA进入快速繁殖的对数生长期，对羧苄西林明显耐药；CSME组在培养0~14 h时间段内的吸光值始终无明显变化(P > 0.05)，在培养时间超过16 h后，CSME组吸光值缓慢增高，表明其进入缓慢增长期，但明显低于空白对照组和羧苄西林组的吸光值(P < 0.05)。见Fig 2。

Fig 2 Inhibition curves of CSME on MRSA *P < 0.05 vs Control; #P < 0.05 vs Carbenicillin

图选项

结果显示，在培养时间12 h后，空白对照组的吸光值明显高于羧苄西林组和CSME组(P < 0.05)，表明RPA进入快速繁殖的对数生长期；羧苄西林组和CSME组在培养0~18 h时间段内的吸光值始终无明显变化(P > 0.05)，在培养时间超过20 h后，羧苄西林组和CSME组吸光值缓慢增高进入缓慢增长期，但CSME组明显低于空白对照组而高于羧苄西林组(P < 0.05)。见Fig 3。

Fig 3 Inhibition curves of CSME on RPA *P < 0.05 vs Control; #P < 0.05 vs Carbenicillin

图选项

结果显示，在培养时间6 h后，空白对照组的吸光值明显高于羧苄西林组和CSME组(P < 0.05)，表明RECO进入快速繁殖的对数生长期；羧苄西林组和CSME组在培养0~12 h时间段内的吸光值始终无明显变化(P > 0.05)，在培养时间超过14 h后，羧苄西林组和CSME组吸光值缓慢增高进入缓慢增长期，但CSME组明显低于空白对照组而高于羧苄西林组(P < 0.05)。见Fig 4。

Fig 4 Inhibition curves of CSME on RECO *P < 0.05 vs Control; #P < 0.05 vs Carbenicillin

图选项

实验证实，ATCC29213、ATCC27853和ATCC25922的耐药基因分别为阳性，而敏感菌株耐药基因为阴性。表明3种菌株为理想耐药菌株^[10]。研究发现，MIC时，92株MRSA对于抗生素耐药率均在60%～80％，对于羧苄西林、头孢唑林、红霉素等的耐药率为100%，与相关文献报道的一致^[11]，明显高于CSME；CSME对MRSA的抑菌圈明显小于头孢曲松、头孢吡肟、亚胺培南，而大于其他抗生素；CSME对RPA的抑菌圈均明显大于其他抗生素；CSME对RECO的抑菌圈明显小于头孢曲松、头孢吡肟、亚胺培南、环丙沙星、呋喃西林，而大于其他抗生素。而且，这种抑制作用随浓度的增加逐增强。其中，CSME对MRSA的敏感率高于其他耐药菌，而对RECO的敏感率低于MRSA和RPA。抑菌曲线研究也显示，CSME抑制MRSA、RPA和RECO的效力强于羧苄西林。表明这3种烧伤创面常见感染耐药菌分别对β-内酰胺类、氨基糖苷类、红霉素类等抗生素耐药，系多重耐药菌，却对高浓度的CSME较为敏感。

烧伤患者常见的并发症就是创面感染，是威胁患者生命和创面瘢痕增生的重要原因，尽管有严格的隔离与消毒技术，往往创面都不可避免的发生感染^[12]。由于抗生素的大量应用，烧伤创面感染菌的耐药也随之产生，特别是多重多种耐药菌的混合感染，常会导致创面经久不愈，甚至危及生命，这是令临床医生棘手的一大难题。烧伤创面感染的耐药菌大多为MRSA、RPA、RECO以及鲍氏不动杆菌、真菌等^[13]。若混合耐药菌感染，一般要选择3~5种抗生素^[14]，这对于本身器官功能状况就不佳的烧伤患者来说，可能会造成更严重的器官功能损伤，而且可能带来多种耐药机制和顽固性耐药的风险^[8]。有研究报道，CSME对金黄葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、黄曲霉菌、肺炎链球菌、芽孢杆菌、白色念珠菌等多种均具有明显的抑制作用^[1]。本研究发现其对MRSA、RPA、RECO有明显的抑制作用。这些菌又是烧伤创面感染的主要菌种，表明CSME适宜于这3种耐药菌的烧伤创面感染。因此，CSME有可能成为有效控制烧伤创面多重耐药菌混合感染的新型药物。

综上，作为外用马桑水提取物治疗感染、烧伤、经久不愈创面以及头癣的民间验方^[2]，就目前研究结果表明，其作用机制至少与促进烧伤创面愈合和抑制烧伤创面常见感染菌密切相关^[3]。至于其抗菌作用机制，我们仍在进一步研究中。