2. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 北京 100850
2. Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850, China
心肌肥大是心血管疾病的主要危害因素，心脏通过肥大来增加心输出量，作为对于外界多种病理刺激的应答反应，包括:压力超负荷、心肌梗死、高血压或是异常的心肌收缩和心脏重构[1-2]。心肌细胞发生肥大，会导致心肌细胞表面积增大及蛋白合成增加，并且会造成细胞内肥大特异性基因、自噬、线粒体功能，肌动蛋白表达等指标的病理性改变，长期发展会造成严重心脏损伤。
血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是哺乳动物体内重要的血压和体液调节激素，是肾素-血管紧张素系统(RAS)的关键效应因子，它除了可直接影响血流动力学外，还是重要的细胞生长因子，可以诱导心肌细胞肥大；促进心脏成纤维细胞增殖；诱导心肌细胞凋亡[3-5]等。
麦冬为百合科沿阶草属植物麦冬(Ophiopogon japonicus (L.f.)KerGawl)的肉质块根，是常用中药之一[6]，具有保护心功能、抗心肌缺血和心肌梗死、抗心律失常、保护血管和微循环、耐缺氧等方面的药理作用。其重要的单体成分之一麦冬皂苷D，同样被证实有多种生物学效应。经研究发现[7-8]，麦冬皂苷D(Ophiopogonin D)具有抗氧化，神经营养及抗炎症，抗血栓[9]，抗DOX引起的心肌损伤凋亡等[10]作用。本实验室前期研究发现麦冬皂苷D通过激活CYP2J3/EETs系统, 能够逆转AngⅡ所致的心肌细胞内钙离子稳态失衡并减少细胞凋亡，显示出良好的心肌细胞保护作用[11]。
本文拟从心肌肥大的角度探究麦冬皂苷D是否对AngⅡ所致的心肌肥大具有干预作用，通过检测AngⅡ诱导的心肌肥大的情况，及其相关的各项病理指标，来探讨麦冬皂苷D对心肌肥大作用的可能机制。希望从多个角度证实麦冬皂苷D的心肌保护作用。
1 材料与方法 1.1 药物、试剂与仪器麦冬皂苷D (Ophiopogonin D)购于上海一飞生物科技有限公司，批号:E081384，纯度98%，用二甲基亚砜配制为20 mmol·L-1浓度的溶液，-20℃冻存。血管紧张素Ⅱ购于美国Sigma公司，用二甲基亚砜配制为1mmol·L-1浓度的溶液，-20℃冻存，二甲基亚砜、TRIzol均购于美国Sigma公司。进口澳洲胎牛血清购于GenStar生物技术有限公司；DMEM高糖培养基、PBS、胰蛋白酶购于美国Gibco BRL公司；MTS试剂盒购于Promega生物技术有限公司；引物使用Primer Premier 6.0设计并由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成；qPCR两步法试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购于康为世纪公司；RIPA细胞裂解液购于美国Thermo公司；LC3B抗体购于美国Abcam公司，货号:ab48394；线粒体膜电位染料Mito Tracher Red CMXRos购于赛默飞生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
CO2培养箱，美国Thermo公司；VICTOR X型多标记酶标仪，美国Perkin Elmer公司；IN CELL Analyzer 2000仪器，美国GEHealthCare公司，用于高通量筛选；Microfuge 22R型离心机，美国Beckman公司；Nanovue型超微量分光光度计，英国GE公司；GeneAmp PCR System 2400型PCR仪，美国Applied Biosystem公司。
1.2 细胞系和细胞培养大鼠心肌细胞系H9c2购自北京协和细胞资源中心。细胞贴壁生长于体积分数为0.1灭活胎牛血清的DMEM高糖完全培养基中，向其加入100 kIU·L-1的青霉素和100 mg·L-1链霉素，37℃，体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。体积分数为0.125的胰蛋白酶消化传代。细胞按常规方法培养，当细胞在6孔板内生长聚集，密度占到0.60~0.80时，加入1μmol·L-1的AngⅡ经过24h来诱导心肌肥大。
1.3 实验分组及药物干预用不同浓度的AngⅡ和OP-D对细胞活力进行检测，再将实验分为3组，对照组:仅加入等量的与其他组相同的细胞培养液；模型组:加入终浓度为1μmol·L-1的AngⅡ，培育24h；AngⅡ+OP-D 3个不同浓度组(治疗组):AngⅡ(1μmol·L-1)分别和0.1、0.25、0.5μmol·L-1 3个不同浓度的麦冬皂苷D同时处理，培育24h。每组至少3个复孔，实验重复3次。
1.4 麦冬皂苷D及AngⅡ的毒性检测将处于对数生长期的H9c2细胞经体积分数为0.125的胰酶消化后，制成细胞悬液，随机接种于96孔板中(1×105个/孔)，孵育24h后，用体积分数为0.02胎牛血清但不含青链霉素的DMEM高糖培养基，配制成终浓度为0.1、1、10、100 μmol·L-1的AngⅡ，和终浓度为0.5、5、50、100 μmol·L-1的麦冬皂苷D均加入到96孔板细胞中，每个浓度设4个平行复孔，同样设置空白对照组4个复孔，置于37℃的CO2培养箱中。培养24 h后，每孔吸走20 μL细胞上清液，再避光加入MTS试剂每孔20 μL，并设调零孔，置培养箱中继续培养2~3h后，在酶标仪550nm处测定吸光度A，并进行统计分析。公式:细胞活力/%=(药物组平均值-调零孔值)÷(对照组平均值-调零孔值) ×100%。
1.5 肥大心肌细胞总蛋白含量检测按照实验分组，药物作用完毕后，移除6孔板中的培养液，PBS液冲洗2次。再加入含体积分数为0.01蛋白酶抑制剂的适量RIPA细胞裂解液，收集提取的蛋白后适当稀释，采用BCA法，根据标准品曲线检测出各孔心肌细胞蛋白浓度。用公式计算:总蛋白含量=蛋白浓度×稀释倍数×蛋白体积。
1.6 qRT-PCR检测麦冬皂苷D对AngⅡ诱导的心肌细胞BNP，β-MHC基因mRNA表达的影响取对数生长期的细胞在6孔板中培养24h，分别以实验分组进行给药，药物处理24h后，采用TRIzol方法提取细胞总RNA。用紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度(OD260/280比值在1.8~2.0)，qRT-PCR试剂盒进行反转录获得cDNA:取Oligo(dT)1 μL，加入RNA样本1 μg, 补DEPC水至9 μL，加入E-Mix 1 μL，R-Mix 10 μL，放入PCR仪中42℃×15 min，85℃×5 s灭活；反转录后得到cDNA于-20℃保存。建立20 μL的PCR反应体系:2 μL的cDNA，10 μmol·L-1的上下游引物各0.4 μL，10 μL的2×Tap mix，0.4 μL的Passint Reference Dye 1，补水至20 μL。PCR扩增仪扩增目的基因片段，反应条件为:94℃ 30 s，94℃ 5 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s，共40个循环。特异性引物序列见Tab 1。
| Gene | Primer(5′-3′) |
| GAPDH | Sense:CCTGGAGAAACCTGCCAAGTATGA |
| Antisense:TTGAAGTCACAGGAGACAACCTGG | |
| BNP | Sense:GAGAGCAGGACACCATCGCA |
| Antisense: TGTTCTGGAGACTGGCTAGGAC | |
| β-MHC | Sense: ACTGTCAACACTAAGAGGGTCA |
| Antisense: TTGGATGATTTGATCTTCCAGGG |
将细胞接种于96孔黑色透底培养板，待细胞生长24h且密度达0.60~0.80时，按实验分组给药，药物处理24 h后，加入线粒体膜电位染料和核染料，37℃孵育1 h后弃液，加入体积分数为0.04的甲醛固定20 min后，弃液加入1×透膜液避光孵育30 min，弃液用PBS洗两次，随之用含5%的BSA室温封闭1 h，弃液加入LC3B一抗工作液每孔40 μL，室温避光孵育2h后，用封闭液洗3次，再加入相应二抗工作液每孔50 μL，室温避光孵育1 h，弃液用PBS洗三次后，上机检测。
1.8 Western blot检测LC3B的蛋白水平在先前实验分组的前提下，再分别给予15μmol·L-1的羟氯喹(Qcl)，羟氯喹是溶酶体抑制剂，可抑制LC3Ⅱ的降解，使细胞内的自噬过程停留在最后阶段，从而更容易检测自噬发生的强弱情况。处理过程:用体积分数0.125的胰蛋白酶消化细胞，经PBS洗涤后，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取H9c2细胞总蛋白，利用BCA法测定蛋白质浓度，整合归一浓度后，用Western blot法检测，数据结果用Image J软件计算其灰度值，观察LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白水平变化。
1.9 统计学处理检测结果均以x±s表示，组间用单因素方差分析(ANOVA，LSD)分析，组内比较采用独立或配对t检验，P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 麦冬皂苷D和AngⅡ对细胞活力的影响利用MTS法对麦冬皂苷D和AngⅡ对细胞的毒性影响进行检测，结果如Fig 1所示，随着麦冬皂苷D浓度的增加，细胞活力呈明显下降趋势，50 μmol·L-1的麦冬皂苷D对心肌细胞有明显的毒性作用(Fig 1A)；而用AngⅡ 0.1~100 μmol·L-1的浓度进行处理，其对细胞活力的影响与对照组相比差异并无显著性(Fig 1B)。
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| Fig 1 Effect of OPD and AngⅡ on cell viability of H9c2 cells (n=4, x±s). (1A)Effect of Ophiopogonin D on cell viability.(1B) Effect of AngⅡ on cell viability. *P < 0.05 vs control |
实验结果如Fig 2所示，与对照组相比，心肌细胞在AngⅡ刺激下，蛋白总量明显增加(Fig 2A)；而麦冬皂苷D共处理组，心肌细胞蛋白表达总量与AngⅡ单处理组相比，有明显减弱的趋势(Fig 2B)。提示AngⅡ通过增加心肌细胞蛋白合成导致心肌细胞肥大，麦冬皂苷D有一定抑制心肌细胞肥大作用。
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| Fig 2 Effect of OPD on expression of cardiomyocytes total protein content Induced by Angiotensin Ⅱ (n=4, x±s). (2A) Effect of AngⅡ on expression of total protein content. (2B) Expression of total protein content for OP-D and AngⅡby BCA analysis. **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs The AngⅡ. |
qRT-PCR检测AngⅡ干预心肌细胞24h后的肥大基因BNP、β-MHC的表达，结果如Fig 3所示，模型组与对照组相比，BNP和β-MHC mRNA的表达均明显上升；给予麦冬皂苷D处理后，AngⅡ所诱导的BNP和β-MHC mRNA的上调得到明显抑制。此结果提示麦冬皂苷D能够有效抑制AngⅡ诱发的肥大基因上调。
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| Fig 3 Effect of OPD on the mRNA expression levelof BNP and β-MHC induced by AngⅡin H9c2 cells(n=3, x±s) (3A) mRNA quantification for BNP by qRT-PCR. (3B) mRNA quantification for β-MHC by qRT-PCR. **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs The Ang Ⅱ |
实验结果如Fig 4所示，与正常组(Fig 4A)的线粒体膜电位相比较，AngⅡ诱导24 h后可检测到线粒体膜电位明显下降(Fig 4B)，而用麦冬皂苷D的不同浓度进行干预后(Fig 4C-E)，AngⅡ导致线粒体膜电位下降的效应被明显逆转。证明因心肌细胞肥大造成的线粒体膜电位下降可被麦冬皂苷D所逆转。
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| Fig 4 The effect of OPD on the mitochondrial membrane potential in H9c2 cells A:Normal control; B:AngⅡ (1 μmol·L-1); C~E:AngⅡ+OPD(0.1、0.25、0.5μmol·L-1 respectively).(n=3, x±s). *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs The AngⅡ. |
检测结果如Fig 5所示，与正常组(Fig 5A)的自噬相比较，AngⅡ诱导心肌肥大的同时，自噬的表达明显增强(Fig 5B)，自噬小体数量明显升高，而用麦冬皂苷D的不同浓度进行干预后(Fig 5C-E)，能够下调AngⅡ对自噬的诱导作用。
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| Fig 5 The effect of OPD on the expression of autophagy protein LC3B in H9c2 cells(n=3, x±s) A:Normal control; B:AngⅡ 1 μmol·L-1; C~E:AngⅡ+OPD(0.1、0.25、0.5 μmol·L-1 respectively). **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs The AngⅡ. |
本实验为达到更好的反映自噬强弱的效果，将羟氯喹(15 μmol·L-1)加入实验组进行同时处理。羟氯喹是溶酶体抑制剂，可以有效地阻止自噬体的降解，从而使自噬体聚集在细胞内，通常将羟氯喹组作为对照组之一来反映自噬体形成标志。实验结果如Fig 6所示，正常细胞加入羟氯喹后，也会发生一定的LC3-Ⅱ蛋白聚集，而AngⅡ则更加明显地增加了LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值，加入麦冬皂苷D后，有明显的减弱趋势。
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| Fig 6 The effect of OPD on relative expression of autophagy protein LC3B in hypertrophic cardiomyocytes (n=3, x±s). *P < 0.05 vs control; **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs The AngⅡ. |
心脏肥大是血压升高导致的心脏损伤的生理病理反应，起初肥大是一种由于受损伤后的代偿性反应，是缺血性心脏病、心律失常和心源性猝死[12]的独立危险因素，进一步发展就会损伤心脏功能，最终导致心衰[13]。而由AngⅡ引发的肾血管型高血压，可诱导左心室肥大[14-15]，与此同时，心肌细胞内自噬会被左心室肥大激活，且导致心脏功能衰退，造成线粒体降解[16]。自噬为细胞的一种自我保护机制，可清除胞内受损线粒体和异常折叠的蛋白质，其作用性质与诱发因素有关，然而在重度压力负荷或左心室失代偿情况下，自噬会被过度激活，从而引发自噬性细胞死亡，造成心功能障碍。
本研究结果表明，麦冬皂苷D在较高浓度会对细胞造成毒性作用，而较低浓度会起到保护作用；AngⅡ的激素调节效应，在0.1~100μmol·L-1的浓度作用于心肌细胞时，均不造成细胞的死亡，反而长时间可有细胞增殖作用。从检测总蛋白合成的结果看，AngⅡ诱导的肥大导致总蛋白量与对照组相比有明显的提高，而用麦冬皂苷D进行干预后，对总蛋白表达的增多有一定的逆转作用。一些胚胎基因在成体心脏中的重新表达是AngⅡ造成的肥大反应之一[17-18]，Real time PCR检测AngⅡ干预心肌细胞24 h后的肥大基因BNP，β-MHC的mRNA表达发现，相对于对照组，BNP和β-MHC基因的表达均明显上升，给予麦冬皂苷D处理后，肥大基因表达的上调得到明显抑制，提示麦冬皂苷D能够有效抑制AngⅡ诱发的肥大基因，起到减缓肥大的作用。研究发现，多种细胞在不同因子作用下发生凋亡时均伴有线粒体膜电位的下降[19]，从肥大的角度，长期过度的应激反应，同样导致线粒体降解和膜电位的下降，本实验用高内涵技术检测线粒体膜电位在AngⅡ诱导24h后的变化，与对照组相比，AngⅡ组可明显造成线粒体膜电位的下降，而经麦冬皂苷D同时处理后，线粒体膜电位得到恢复且呈一定量效关系。在AngⅡ诱导的自噬过表达情况下，用麦冬皂苷D进行干预，并用高内涵技术检测，观测到细胞的自噬水平经干扰后有明显的恢复。蛋白水平检测自噬表达的强弱，自噬发生可检测到两条蛋白条带，由于在自噬过程中，细胞内的LC3总蛋白含量不变，而是由一部分LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转变，那么自噬的发生应该表现为LC3Ⅰ的减少和LC3Ⅱ的增加，可通过LC3Ⅱ/LC3Ⅰ或者LC3Ⅱ/(LC3Ⅰ+LC3Ⅱ)的比值来反映自噬水平[20]，本实验中加入溶酶体抑制剂羟氯喹，抑制LC3-Ⅱ蛋白被溶酶体降解，从而使其在胞内聚集，且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值越大，证明自噬发生的强度越强。由实验结果可以看出，AngⅡ组明显地增加了细胞的自噬，而给予麦冬皂苷D干预后，自噬被明显削弱，预示麦冬皂苷D可通过减弱自噬而起到干预心肌肥大的作用。
综上所述，麦冬皂苷D能够明显下调AngⅡ所诱导的心肌肥大的各项特异性指标，同时也可改善AngⅡ引起的自噬及线粒体功能发生的病理性改变，提示麦冬皂苷D可能通过抑制自噬的过度发生和稳定线粒体膜电位，来缓解AngⅡ所引起的心肌肥大，对心肌细胞起到一定的保护作用，但具体保护机制有待于进一步的研究。
(本实验在军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理研究所完成，感谢高月研究员和王宇光副研究员在研究思路、实验方法以及技术理论上的悉心指导。)
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