多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一种常见的疾病，估计影响5.6%生殖期中国女性^[1]。目前现代医学治疗PCOS多采用生活方式干预和药物治疗，存在不良反应及用药后易复发的弊端^[2]，随着中医对 PCOS 研究的不断深入，认识到肾虚血瘀是PCOS的基本病机^[3]。补肾化瘀方为甘肃省中医院妇科经验方。临床观察表明补肾化瘀方对多囊卵巢综合征病例有显著疗效。通过动物实验研究促炎因子TNF-α变化来阐述补肾化瘀方对多囊卵巢综合征的作用机制。

1 材料 1.1 实验动物

6周龄SD ♀大鼠120只(体质量180 g±20 g)由甘肃中医药大学动物实验中心提供，批号：SYXK(甘)2011-0001-62001000000039，SPF级。

1.2 主要试剂

补肾化瘀方由甘肃省中医院药剂室制成水煎剂，4℃保存备用。二甲双胍片(H20080697) ；TNF-α抗体(ab6671) 。依据人与大鼠之间用药剂量换算，将补肾化瘀方配成等容量溶液，中药含量分别为1.98 g·mL^-1(高剂量)、0.989 g·mL^-1(中剂量)、0.495 g·mL^-1(低剂量)，二甲双胍组4.498 g·L^-1。

1.3 PCOS大鼠模型制备和取材

120只大鼠按随机数字表法分为正常组，模型组，对照组，中药低、中、高剂量组6组，各20只，按参考文献^[4]以来曲唑法连续灌胃24 d制作模型，并进行模型鉴定。鉴定成功后按照等容量灌胃，正常组和模型组予生理盐水1 mL·kg^-1·d^-1灌胃，对照组予4.498 mg·kg^-1·d^-1二甲双胍灌胃，补肾化瘀方予高剂量1.98 g·kg^-1·d^-1、中剂量0.989 g·kg^-1·d^-1、低剂量0.495 g·kg^-1·d^-1灌胃，持续14 d。大鼠于80 d龄左右，行腹主动脉取血后脱臼处死，取大鼠卵巢、肝脏、脂肪，置于液氮中2 h后转移至-80℃冰箱保存。

2 方法 2.1 Western blot检测大鼠肝脏、卵巢、脂肪蛋白表达

TNF-α蛋白在肝脏、卵巢、脂肪表达的检测采用Western blot方法，取各组肝脏、卵巢、脂肪组织各100 mg用组织裂解液裂解并匀浆，4℃离心0.5 h，上清液作标本。电泳分离、封闭、结合一抗(1 ∶1 000) ，洗涤、结合稀释好的二抗(抗兔 Ig G)孵育，洗膜后用ECL显像曝光，应用光密度扫描仪测各条带密度，同时以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照。

2.2 数据处理

实验数据用SPSS22.0统计软件分析，数据用x±s表示，采用单因变量多因素方差分析。

3 结果

模型组肝脏、卵巢、脂肪组织中TNF-α蛋白表达明显高于正常组(均P＜0.01) 。与模型组相比，对照组和中药各剂量组肝脏、卵巢、脂肪组织中TNF-α蛋白表达明显降低(均P＜0.01) 。中药各剂量组肝脏、卵巢、脂肪组织中TNF-α蛋白表达相比较，中药中剂量组为最优剂量，差异有统计学意义(P＜0.05) ，中药中剂量组优于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05) 。见Tab 1。

4 讨论

国内外学者提出了许多相关机制学说，其中炎症学说是当今国内外的一个研究热点。TNF-α影响卵泡发育和类固醇生成^[5]，近年来有学者^[6]提出PCOS是一种慢性炎症性疾病，Mattyasovszky等^[7]研究发现PCOS经常遭受慢性炎症的特别是促炎细胞因子TNF-α影响，且TNF-α影响卵泡生长、排卵和黄体衰退。通过Thathapudi等^[8]实验发现，PCOS患者与健康组相比，血清中TNF-α、雄激素明显升高，表明TNF-α可能是导致PCOS的发病原因，目前临床治疗 PCOS 多采用生活方式干预辅以西药药物治疗^[9]，存在诸多不良反应和用药后易复发的弊端。

本实验结果示：TNF-α和PCOS形成关系密切，同时补肾化瘀方能降低组织中炎症因子TNF-α，减缓PCOS的形成。补肾化瘀方组疗效与二甲双胍对照组疗效进行对比，补肾化瘀方有效降低TNF-α表达水平。补肾化瘀方通过抑制TNF-α治疗PCOS，这可能是其有效防治PCOS的机制之一。但是，由于小样本分析，此结果仍需在后续实验中得到验证。总体而言，促炎症因子TNF-α升高能够形成PCOS，而补肾化瘀方通过益肾精，化瘀滞，降低TNF-α水平，进而证明其能起到预防和治疗多囊卵巢综合征的作用，为预防和治疗多囊卵巢综合征提供一种新选择。

( 致谢: 本实验在甘肃中医药大学分子实验室完成，在此深表感谢！ )