2. 广州心血管疾病研究所,广东 广州 510260;
3. 河南应用技术职业学院,河南 郑州 450042
2. Guangzhou Institute of Cardiovascular Disease, Guangzhou Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Guangzhou 510260, China ;
3. Henan Vocational College of Applied Technology,Zhengzhou 450042,China
糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一组由胰岛素分泌和(或)作用缺陷所引起，以慢性血糖水平增高为特征的代谢性疾病。它可以分为两种类型:1型或胰岛素依赖型糖尿病和2型或非胰岛素依赖糖尿病。1型是由胰脏胰岛B细胞被破坏造成。2型是由于胰岛素功能受损造成[1]。近年来，糖尿病发病率逐年增高，2014年国际糖尿病联合会(International diabetes federation, IDF)根据人口增长、人口老龄化、生活方式城市化、运动减少等危险因素预计到2035年全球糖尿病患者将达到6亿，换言之在10亿人口中每8个人当中就有1位糖尿病患者[2-3]。糖尿病及其并发症已经成为威胁人类生命健康的重大疾病之一, 是引起人类死亡的全球第五大疾病[4-5]。糖尿病的病因和发病机制极为复杂，至今未完全阐明，因此建立有效的治疗方法和手段，对于改善糖尿病患者生活质量，延长患者寿命，具有十分重要的意义。
香芹酚作为一种单萜酚，是大多数芳香植物来源的植物精油主要成分[6]，其具有分子小、脂溶性高、容易通过细胞膜等特点[7]。目前的研究已经证实香芹酚具有抗炎、抗氧化、抗菌等多种生物学作用[8]。它能保护受损心肌、神经组织，抑制肿瘤生长。有研究报道，对2型糖尿病小鼠联合给予香芹酚和罗格列酮后，其可通过下调肝脏中TNF-α和IL-6蛋白表达发挥降血脂和抗炎的作用[9]。Bayramoglu等[10]用25、50 mg·kg-1的香芹酚对STZ诱导的1型糖尿病大鼠连续灌胃给药7 d，发现香芹酚可短期降低糖尿病大鼠血清中总胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和乳酸脱氢酶，改善肝功能障碍。但香芹酚长期使用后对1型糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱的影响，以及在糖尿病并发症中的保护作用目前尚不清楚。因此本研究利用链脲霉素(streptozocin, STZ)建立1型糖尿病小鼠模型，旨在研究香芹酚对糖尿病糖脂代谢紊乱的影响。
1 材料 1.1 药材与试剂① 香芹酚(carvacrol, Aldrich公司，批号9428BJV)；② 链脲佐菌素(STZ, Sigma公司，批号WXBB6772V)。
1.2 实验动物SPF级C57BL/6小鼠，健康，♂，6~7周龄，体质量(20.0±2.0) g，由广东省医学动物实验中心提供，生产许可证SCK(粤)2013-0002。饲养环境模拟自然昼夜条件，温度(22±3) ℃，湿度40%~45%，自由饮水。
1.3 主要仪器① -20℃低温冰箱(日本松下)；② -70℃低温冰箱(日本MDF-381AT)；③ 电子天平(德国BP2215) ；④ 低温高速离心机(德国Hettich)；⑤ 全自动生化分析仪；⑥ 稳豪型血糖仪及血糖试纸(美国强生公司)。
2 方法 2.1 动物造模与分组 2.1.1 造模7~8周龄C57BL/6小鼠腹腔注射0.2%链脲佐菌素45 mg·kg-1·d-1，连续注射5 d。正常组给予等量的柠檬酸缓冲液。注射结束后3 d测小鼠血糖，血糖浓度高于16.7 mmol·L-1的小鼠视为造模成功。
2.1.2 分组糖尿病成模后第4周，检测小鼠血糖持续、稳定升高，进行实验分组，① 正常对照组(control, CON)；② 糖尿病组(diabetes mellitus, DM)；③ 香芹酚低剂量组：糖尿病组+10 mg·kg-1香芹酚组(diabetes mellitus plus 10 mg·kg-1 carvacrol, DM+CAR 10 mg·kg-1)；④ 香芹酚高剂量组：糖尿病组+20 mg·kg-1香芹酚组(diabetes mellitus plus 20 mg·kg-1 carvacrol, DM+CAR 20 mg·kg-1)。每组n=8~12，每天腹腔注射药物1次，连续给药2、4、6周。给药期间，正常饮食，自由饮水。
2.2 指标测量每2周称量小鼠体重，同时使用血糖仪检测小鼠随机血糖。分别在给药2、4、6周后，取血分离血清后，置于-70℃冰箱冷冻。使用自动生化仪器检测血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、总胆固醇、甘油三酯的含量[11]。
2.3 统计学分析统计学方法采用Graphpad Prism 5.0统计软件对数据进行处理。文中所有数据资料以x±s表示，数据运用单因素方差分析法进行比较，多个样本两两比较选择Tukey检验。
3 结果 3.1 体重和随机血糖 3.1.1 体重(body weight, BW)正常小鼠体重随周龄逐渐增加，糖尿病小鼠体重逐渐降低，与正常组小鼠比较具有统计学意义(P＜0.05) ，给药组体重与糖尿病组相比差异无统计学意义。见Tab 1。
| Group | 2 weeks | 4 weeks | 6 weeks |
| CON | 27.7±0.4 | 28.7±0.5 | 30.8±1.1 |
| DM | 22.4±0.3* | 22.7±0.3* | 21.8±0.7* |
| DM+CAR 10 mg·kg-1 | 22.0±0.3 | 21.9±0.3 | 21.5±0.3 |
| DM+CAR 20 mg·kg-1 | 21.8±0.3 | 21.4±0.4 | 21.4±0.4 |
| *P＜0.05 vs CON | |||
正常组随周龄增加血糖稳定。糖尿病组随机血糖随周龄增加持续升高；给药组小鼠的随机血糖随给药时间延长呈剂量依赖性降低。经方差统计分析香芹酚高剂量组血糖与糖尿病组、正常组、低剂量组分别比较，差异均有统计学意义(P＜0.05) ，其中在给药6周时10 mg·kg-1剂量组血糖相比糖尿病组下降41.6％，20 mg·kg-1组下降46.9％。见Tab 2。说明在此模型下，香芹酚对糖尿病小鼠血糖增高有明显抑制作用。
3.2 血脂检测项目 3.2.1 总胆固醇(total cholesterol, CHOL)DM组与正常组相比，总胆固醇水平有所增高，但差异无统计学意义。香芹酚低剂量组和高剂量组的总胆固醇CHOL在给药4周时与糖尿病组的差异有统计学意义(P＜0.05) ，其余各时间点各给药组的差异无统计学意义。见Tab 3 。
| Group | 2 weeks | 4 weeks | 6 weeks |
| CON | 8.4±0.5 | 7.8±0.3 | 7.3±0.9 |
| DM | 26.6±0.9* | 27.2±0.9* | 32.2±2.1* |
| DM+CAR 10 mg·kg-1 | 26.6±0.9 | 23.5±1.2# | 18.7±1.5# |
| DM+CAR 20 mg·kg-1 | 24.2±1.1 | 21.1±1.2# | 17.1±1.6# |
| *P＜0.05 vs CON;#P＜0.05 vs DM | |||
| Group | 2 weeks | 4 weeks | 6 weeks |
| CON | 2.8±0.2 | 2.8±0.2 | 2.7±0.2 |
| DM | 2.9±0.1 | 3.3±0.1 | 2.8±0.2 |
| DM+CAR 10 mg·kg-1 | 3.3±0.2 | 2.9±0.1# | 3.0±0.1 |
| DM+CAR 20 mg·kg-1 | 2.7±0.3 | 2.6±0.1# | 2.6±0.1 |
| #P＜0.05 vs DM | |||
DM组相比CON组血清中甘油三酯含量增高，差异具有统计学意义(P＜0.05) 。香芹酚低剂量组、高剂量组的TG值与糖尿病组在各时间点的差异均有统计学意义(P＜0.05) 。见Tab 4 。
| Group | 2 weeks | 4 weeks | 6 weeks |
| CON | 0.9±0.1 | 1.3±0.2 | 1.3±0.2 |
| DM | 1.4±0.1* | 2.2±0.2* | 2.9±0.2* |
| DM+CAR 10 mg·kg-1 | 0.9±0.0# | 1.5±0.2# | 1.4±0.1# |
| DM+CAR 20 mg·kg-1 | 0.8±0.1# | 1.3±0.1# | 1.2±0.1# |
| *P＜0.05 vs CON;#P＜0.05 vs DM | |||
在给药6周时，DM组与CON组相比AST值差异有统计学意义(P＜0.05) 。同时ALT随糖尿病进程加长有明显升高，DM组与CON组相比ALT值差异有统计学意义(P＜0.05) ，但DM组和香芹酚给药组的AST、ALT差异均没有统计学意义。见Tab 5、Tab 6。
| Group | 2 weeks | 4 weeks | 6 weeks |
| CON | 130.0±8.3 | 184.2±15.9 | 240.2±4.4 |
| DM | 128.7±8.1 | 174.3±5.3 | 351.1±4.9* |
| DM+CAR 10 mg·kg-1 | 138.2±11.9 | 174.8±9.0 | 365.0±3.5 |
| DM+CAR 20 mg·kg-1 | 154.7±8.6 | 188.4±13.1 | 347.1±6.0 |
| *P＜0.05 vs CON | |||
| Group | 2 weeks | 4 weeks | 6 weeks |
| CON | 36.0±6.5 | 38.2±4.1 | 37.2±2.4 |
| DM | 49.8±3.3* | 50.9±2.2* | 53.9±5.0* |
| DM+CAR 10 mg·kg-1 | 49.4±2.5 | 49.9±4.6 | 54.5±2.6 |
| DM+CAR 20 mg·kg-1 | 43.5±2.9 | 53.7±6.1 | 51.2±4.1 |
| *P＜0.05 vs CON | |||
DM组与同周龄CON组相比，血清LDH含量增高，在给药4周、6周时，DM组与CON组间LDH的差异具有统计学意义(P＜0.05) 。给药组与DM组相比，随给药时间延长血清LDH含量逐渐降低；连续给药4周、6周后，高剂量组的LDH值与糖尿病组相比明显下降，其差异具有统计学意义(P＜0.05) 。其余各时间点及给药组的LDH值差异无统计学意义。见Tab 7。
| Group | 2 weeks | 4 weeks | 6 weeks |
| CON | 669.4±119.6 | 667.0±94.1 | 622.0±130.7 |
| DM | 716.9±108.6 | 896.7±85.3* | 777.8±143.7* |
| DM+CAR 10 mg·kg-1 | 793.1±47.9 | 889.3±154.5 | 777.0±46.3 |
| DM+CAR 20 mg·kg-1 | 651.9±114.1 | 535.3±45.5# | 474.4±29.6# |
| *P＜0.05 vs CON;#P＜0.05 vs DM | |||
香芹酚是一种芳香酚单萜类化合物，C10H14O，发现于植物如牛至和薄荷中，用于配制香料、杀菌剂和消毒剂，作为香料用于牙膏、香皂等日用品，也用作食用香精[7]。近年来，多项研究表明，香芹酚具有多样的生物活性，如抗菌、抗病毒、抗真菌及原虫[8]，在生理系统有抗炎、抗癌、保护心肌组织和神经细胞等作用。
近年来，香芹酚在代谢系统疾病中的作用，引起人们日益关注。糖尿病作为以血糖升高为特征的代谢性疾病，易引发冠心病、高血压、高血脂等多种并发症。目前香芹酚在糖尿病中对糖脂代谢的调控作用尚不明确。有研究发现，香芹酚具有抗氧化作用，它能通过保护糖尿病大鼠神经系统，改善认知功能障碍。Bayramoglu等[10]通过腹腔注射STZ建立1型糖尿病大鼠模型，连续7 d给予大鼠25、50 mg·kg-1的香芹酚灌胃，发现其能明显降低血清总胆固醇、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶，并能抑制肝坏死和改善肝功能障碍，但对血糖的影响较小。Ezhumalai等[9]发现对高脂饮食诱导的小鼠代谢综合征模型联合给予香芹酚和罗格列酮，能明显降低血清总胆固醇、甘油三酯、血磷脂、游离脂肪酸水平，并抑制炎症因子表达。但目前为止，长期使用香芹酚对糖尿病小鼠血糖、血脂及其并发症的影响暂未见报道，其作用机制亟待深入研究。本实验通过腹腔注射不同剂量香芹酚检测糖尿病小鼠体重、血糖、血脂、肝功能变化，评价香芹酚对1型糖尿病小鼠糖脂代谢的影响，为下一步对其作用机制的研究奠定实验基础。
本研究结果发现，长期连续给予1型糖尿病小鼠10、20 mg·kg-1的香芹酚其血糖与同周龄未给药的糖尿病小鼠相比，随机血糖(Tab 2)呈剂量依赖性明显降低，说明其长期使用具有良好的降血糖效果。糖尿病糖脂代谢紊乱是导致并发症的主要影响因素，当血糖控制水平和病程基本一致的情况下，脂代谢紊乱严重程度对并发症的形成有重要作用。本实验中，尽管糖尿病组未见血胆固醇有明显改变(Tab 3)，但糖尿病小鼠血甘油三酯(TG)比正常组明显升高，给予低、高剂量香芹酚后小鼠TG水平与糖尿病组相比均明显降低，并呈剂量依赖趋势；高剂量组给药后TG水平基本恢复至正常，该结果说明香芹酚可在一定程度上改善糖尿病糖脂代谢紊乱，20 mg·kg-1香芹酚剂量降糖、降血脂效果更强。谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)主要存在于肝细胞中，是肝功能检查的主要指标，在急慢性肝功能损伤时，AST、ALT会有所升高。尽管有文献报道香芹酚在代谢综合征模型中能降低AST、ALT，保护肝脏功能[9]，但本实验中，我们对糖尿病小鼠长期给予香芹酚暂未发现其能使AST、ALT降低。造成此结果差异的原因可能是由造模程度不同所致。乳酸脱氢酶(LDH)是一种存在于细胞质中，参与糖酵解最后一步的催化酶，正常极少存在于血浆中，但某些疾病时受损的细胞会释放LDH入血，导致LDH在血浆中含量增高。故临床上常用血清LDH活性来判断疾病和评价药物治疗作用。本实验中，给予香芹酚使血LDH明显降低，说明其能改善细胞受损，对损伤细胞具有保护作用(Tab 7)。
目前，香芹酚对糖尿病糖脂代谢调控的机制研究甚少。Ezhumalai等[12]研究发现，将罗格列酮和香芹酚联合给药可使高脂饮食诱导的代谢综合征小鼠肝脏中碳水化合物代谢酶如葡萄糖-6-磷酸酶和果糖-1, 6-二磷酸酶的活性增加，使葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性降低。该研究提示，罗格列酮和香芹酚联合口服给药可通过影响碳水化合物代谢酶的表达对高脂饮食诱导的代谢综合征小鼠糖代谢紊乱发挥调节作用。在脂质代谢方面，香芹酚通过影响脂肪生成及转录因子如PPARγ和C/EBPα及其靶基因如AP2、LPL和瘦素的表达，通过抑制骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子1和甘丙肽介导的信号通路抑制内脏脂肪形成，发挥对高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂代谢的调控作用，并通过抑制Toll样受体信号通路，减少内脏脂肪组织炎症的发生[13]。此外，香芹酚还能上调糖尿病PGC-1α表达。PGC-1α作为PPARγ共活化因子，在糖尿病并发症时表达降低；使用药物上调PGC-1α能通过调控线粒体的代谢与合成，改善糖尿病心肌病的症状[14]。由于本实验中未观察到香芹酚对糖尿病小鼠血清胰岛素有明显影响(结果未列出)，因此我们推测，香芹酚可能通过调节核转录因子PPARα、PPARγ及其共活化因子PGC-1α调控糖脂代谢基因、能量代谢基因的表达，从而改善糖尿病糖脂代谢紊乱，减轻细胞、组织损伤，但其具体降糖降脂机制尚需深入研究。
综上所述，本研究结果表明香芹酚可降低1型糖尿病小鼠血糖，改善糖脂代谢紊乱，有效地保护损伤细胞，对糖尿病及其并发症有一定的治疗作用。
( 致谢: 本实验在广州医科大学动物实验中心，广州医科大学药理实验室、广州心血管疾病研究所完成，在此特对以上实验中心和实验过程中给予指导和帮助的老师表示感谢！ )
| [1] | Daniel R, Gokulanathan S, Shanmugasundaram N, et al. Diabetes and periodontal disease[J]. J Pharm Bioallied Sci, 2012, 4 (Suppl 2) : S280-2 . |
| [2] | Kihara A, Kabeya Y, Ohsumi Y, et al. Beclin-phosphatidylinositol 3-kinase complex functions at the trans-Golgi network[J]. EMBO Rep, 2001, 2 (4) : 330-5 doi:10.1093/embo-reports/kve061. |
| [3] | Zeng X, Overmeyer J H, Maltese W A, et al. Functional specificity of the mammalian Beclin-Vps34 PI 3-kinase complex in macroautophagy versus endocytosis and lysosomal enzyme trafficking[J]. J Cell Sci, 2006, 119 (Pt 2) : 259-70 . |
| [4] | He C, Klionsky D J. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy[J]. Annu Rev Genet, 2009, 43 : 67-93 doi:10.1146/annurev-genet-102808-114910. |
| [5] | Klionsky D J, Cregg J M, Dunn W A, et al. A unified nomenclature for yeast autophagy-related genes[J]. Dev Cell, 2003, 5 (4) : 539-45 doi:10.1016/S1534-5807(03)00296-X. |
| [6] | De Vincenzi M, Stammati A, De Vincenzi A, et al. Constituents of aromatic plants: carvacrol[J]. Fitoterapia, 2004, 75 (7-8) : 801-4 doi:10.1016/j.fitote.2004.05.002. |
| [7] | Yu H, Zhang Z L, Chen J, et al. Carvacrol, a food-additive, provides neuroprotection on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in mice[J]. PloS One, 2012, 7 (3) : e33584 doi:10.1371/journal.pone.0033584. |
| [8] | Hajhashemi V, Ghannadi A, Pezeshkian S K. Antinociceptive and anti-inflammatory effects of Satureja hortensis L. extracts and essential oil[J]. J Ethnopharmacol, 2002, 82 (2-3) : 83-7 doi:10.1016/S0378-8741(02)00137-X. |
| [9] | Ezhumalai M, Ashokkumar N, Pugalendi K V. Combination of carvacrol and rosiglitazone ameliorates high fat diet induced changes in lipids and inflammatory markers in C57BL/6J mice[J]. Biochimie, 2015, 110 : 129-36 doi:10.1016/j.biochi.2014.12.005. |
| [10] | Bayramoglu G, Senturk H, Bayramoglu A, et al. Carvacrol partially reverses symptoms of diabetes in STZ-induced diabetic rats[J]. Cytotechnology, 2014, 66 (2) : 251-7 doi:10.1007/s10616-013-9563-5. |
| [11] | 张雨洁, 兰怡, 李卉, 等. 两色金鸡菊乙酸乙酯提取物对STZ诱导的糖尿病SD大鼠的影响[J]. 中国药理学通报, 2015, 10 (10) : 1439-42 . Zhang Y J, Lan X, Li H, et al. Effect of ethyl acetate extract from coreopsis tinctoria on diabetic SD rats induced by STZ[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 10 (10) : 1439-42 . |
| [12] | Ezhumalai M, Radhiga T, Pugalendi K V. Antihyperglycemic effect of carvacrol in combination with rosiglitazone in high-fat diet-induced type 2 diabetic C57BL/6J mice[J]. Mol Cell Biochem, 2013, 385 (1-2) : p. 23-31 . |
| [13] | Cho S, Choi Y, Park S, Park T. Carvacrol prevents diet-induced obesity by modulating gene expressions involved in adipogenesis and inflammation in mice fed with high-fat diet[J]. J Nutr Biochem, 2012, 23 (2) : 192-201 doi:10.1016/j.jnutbio.2010.11.016. |
| [14] | 曹琼丹, 杨育红, 于胜男, 等. 黄芪甲苷对Ⅰ型糖尿病大鼠心肌细胞PGC-1α和NRF-1表达的影响[J]. 中国药理学通报, 2015 (8) : 1096-100 . Cao Q D, Yang Y H, Yu S N, et al. Effect of astragaloside IV on expression of PGC-1α and NRF-1 in myocardial cells of type I diabetic rat[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015 (8) : 1096-100 . |
中国科协主管,中国药理学会主办
文章信息
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文章历史
- 收稿日期: 2016-05-03
- 修订日期: 2016-05-23