异可利定(isocorydine),亦名异紫堇定或异紫堇定碱，系自防己科千金藤属植物白线薯(Stephaniabrachyandra Diels)或头花千金藤(Stephaniace pharantha Hayats)的块根经分离提取而得。是一种异喹啉类阿朴菲型(aporphine)生物碱，具有多种生理活性[1-2]。
冠心病、心肌梗死等常见疾病是由心肌缺血引起的，最有效的治疗方法就是对缺血心肌进行再灌注，而再灌注可引起缺血/再灌注损伤。其中，再灌注心律失常是其主要表现之一[3]。心肌缺血后最有效的治疗方式是恢复心肌血流灌注，但再灌注会导致可逆性缺血损伤加重，或使其转化为不可逆性损伤，这种现象称为心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。再灌注性心律失常(reperfusion arrhythmia，RA)是 MIRI中的一种主要表现形式。再灌注心律失常表现形式多样，常见室性早搏(ventricular extrasystole，VE)、室性心动过速(ventricular tachycardia，VT)及心室颤动(ventricular fibrillation，VF)等快速心律失常，还有窦性心动过缓、房颤、房室传导阻滞等慢性再灌注心律失常[4-5]。
前期实验表明，异可利定静脉注射对氯仿、乌头碱、氯化钡、氯化钙及肾上腺素等引起的多种动物心律失常有效[6-7]。本实验采用大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型，旨在进一步观察、研究异可利定对大鼠冠状动脉结扎所致大鼠心律失常的作用及心肌缺血/再灌注损伤的保护作用，并初步探讨其机制，为推广应用提供科学依据。这一类生物碱所表现的生物活性与其结构密切相关，并且多种活性之间存在较好的相关性，深入开展其结构与活性之间、活性与活性之间的相关性研究，不仅对了解药物作用机制、优化先导物结构、阐释传统中药作用机制具有重要意义。且云南有丰富的山乌龟亚属植物资源，能为研究提供种类丰富、数量充足的异喹啉类生物碱原料。
1 仪器与材料 1.1 仪器动物呼吸机(HX-200，成都泰盟科技有限公司)；生物机能实验系统(BL-420E，成都泰盟科技有限公司)；带线缝合针(上海浦东金环医疗用品股份有限公司)；高速分散器(XHF-I，宁波新芝生物科技股份有限公司)；台式离心机(TGL-16G，上海安亭科学仪器厂)；电子天平(SartoriusBT25S，赛多利斯科学仪器北京有限公司)；超声机(SK250HP，上海科导超声仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9023A，上海一恒科学仪器有限公司)。
1.2 药品与试剂异可利定(纯度为99.4%，实验室自制)，盐酸维拉帕米注射液(上海禾丰制药有限公司，批号43150401)，水合氯醛(AR，天津市大茂化学试剂厂，批号20150715)，甲醛溶液(AR，四川西陇化工有限公司，批号141022)，TTC(Biosharp，批号T8877)，0.5%埃文斯蓝染色液(北京索莱宝科技有限公司，批号20150908 )，SOD、MDA、GSH-Px试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)，其余试剂均为分析纯。
1.3 动物SD大鼠，SPF级，♂，(220±30)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2011-0003。
2 方法 2.1 动物分组及药物处理取SD ♂健康大鼠96只，随机分为假手术(sham operation，Sham)组、心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，I/R)模型组、阳性对照组盐酸维拉帕米组、异可利定(2.5、5、10 mg·kg-1)组，共6组，每组16只。各组动物在结扎冠脉前3 min经股静脉给予相应药物，Sham组和心肌缺血/再灌注模型组给予生理盐水注射[8-9]。
2.2 大鼠在体心肌缺血/再灌注造模方法大鼠用100 g·L-1水合氯醛溶液(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉并固定。① 暴露气管，气管插管，用小动物呼吸机正压通气(潮气量为每20~30 mL·kg-1，吸呼比2 ∶3，频率70~75次/min)，记录Ⅱ导联ECG。② 经股静脉给药后3 min，沿胸骨左缘心脏搏动处纵行切开皮肤约2 cm，逐层分离皮下组织、肌肉，胸前肌肉及筋膜3~4 cm，在心脏搏动最明显处，于左侧第四肋间，用止血钳钝性分离肋间肌长3 cm，打开胸腔，撑开第4和第5肋骨，轻轻剪开心包膜，用左手拇指及四指将心脏轻轻挤出胸腔。在左心耳下方2 mm处用眼科小圆针5/0丝线穿线，进针深度为1~1.5 mm，宽2~3 mm，连同心大静脉一齐结扎冠状动脉左前降支，打一个活结结扎。结扎冠状动脉后，迅速将心脏放入胸腔，轻挤胸腔排出胸腔气体，用止血钳夹紧皮肤闭合胸腔，除Sham组大鼠只挂线不结扎外，其余各组均结扎左冠状动脉前降支(left anterior descending，LAD)[10-12]。15 min后松开LAD，再灌注30 min，结扎成功的标志是缺血区呈紫绀，心电图示ST段抬高。冠状动脉再通标志是缺血区转红，ST段降低。③制备心肌梗死范围心脏标本：各组有一半动物在缺血/再灌注结束后，再次原位结扎LAD，经动脉导管推注质量分数为0.5%埃文斯蓝染色液1 mL，待大鼠巩膜蓝染后迅速取出心脏，在冷生理盐水(4 ℃)中冲洗，并剪去心房和右室游离壁，滤纸吸干水分，-20 ℃保存。④ 制备生化指标检测心脏标本：各组另一半大鼠取出心脏后，迅速于冷生理盐水中冲洗并剪去心耳、大血管，称重后-20 ℃保存。
2.3 心律失常评分方法观察缺血/再灌注期间大鼠心电图曲线(评判标准见Fig 1)，记录VE出现次数，VT发生率及累积持续时间，VF发生率和持续时间。
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| Fig 1 Arrhythmia ECG A:Normal ECG;B:VE;C:VT;D:VF;E:ST elevation |
取冷冻(-20 ℃)心脏标本，沿左室长轴切成1.0 mm厚的薄片，置于质量分数为1%的TTC溶液中，37 ℃孵育20 min，然后用体积分数为10的甲醛溶液固定。蓝色心肌为非缺血心肌组织，粉色为缺血但未坏死心肌组织，苍白色为缺血坏死心肌组织。吸干水分后，用解剖刀剔去不同颜色心肌组织(评判标准见Fig 2)，分别称重，并按公式计算心肌缺血范围(ischemic zone size)和心肌梗死范围(infarction size)。
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| Fig 2 Dyeing myocardial ischemia |
心肌缺血范围和心肌梗死范围的重量比率计算公式：
心肌缺血范围/%=(红色+苍白色)/左室×100%
心肌梗死范围/%=苍白色/(红色+苍白色)×100%
2.5 心肌组织生化指标测定用匀浆机将心脏制0.25 kg·L-1心肌组织生理盐水匀浆，测定SOD、MDA、GSH-Px等生化指标，测定方法按试剂盒说明进行。
| Group | Dose/ mg·kg-1 | Occurrence time /min | Duration /min | Incidence of arrhythmia/% | ||
| VE | VT | VF | ||||
| Sham | - | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| I/R | - | 1.05±0.42 | 8.72±2.77 | 100 | 91.6 | 75 |
| Verapamil | 2.5 | 4.39±1.93* | 4.54±1.21* | 100 | 50* | 40* |
| Isocorydine | 2.5 | 3.08±1.07* | 4.66±2.05* | 83.3 | 60* | 40* |
| 5.0 | 5.62±2.18** | 3.08±1.27** | 100 | 30** | 20** | |
| 10.0 | 3.46±1.29* | 5.19±1.01* | 100 | 40* | 30* | |
| *P＜0.05，**P＜0.01 vs I/R | ||||||
计量资料采用x±s表示，用单因素方差分析(ANOVA)处理；计数资料用χ2检验处理。采用SPSS 19统计软件进行统计分析。
3 结果 3.1 异可利定对大鼠心肌缺血及再灌注心律失常的影响缺血及再灌注期间，与I/R组比较，维拉帕米组降低VT发生率及VF发生率，且能明显地推迟心律失常发生的时间，缩短心律失常持续的时间，差异具有统计学意义(P＜0.05)。异可利定各剂量组均能不同程度降低VT发生率及VF发生率，差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；且能明显地推迟结扎冠状大鼠室性心律失常发生的时间，缩短心律失常持续的时间，差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，且异可利定中剂量组比维拉帕米组有好的趋势。但是都对VE作用不明显，结扎大鼠冠状动脉左前降支后大约3 min，易出现室性心律失常。见Tab 1。
3.2 异可利定对大鼠心肌缺血面积和心肌梗死范围的影响假手术组无心肌缺血及心肌梗死现象，与I/R组比较，维拉帕米组与异可利定各剂量组均能不同程度降低缺血及再灌注期间大鼠心肌缺血范围，明显减少缺血期间大鼠心肌梗死范围，差异具有统计意义(P＜0.05，P＜0.01 )。见Tab 2。
| Group | Dose/ mg·kg-1 | Ischemic zone/% | Infarction size/% |
| Sham | - | 0 | 0 |
| I/R | - | 66.63±7.57 | 34.86±5.95 |
| Verapamil | 2.5 | 52.17±7.52* | 19.00±13.34* |
| Isocorydine | 2.5 | 53.39±11.98* | 19.52±6.20* |
| 5.0 | 55.19±5.39* | 26.84±8.29 | |
| 10.0 | 53.29±8.46** | 19.08±12.32* | |
| *P＜0.05，**P＜0.01 vs I/R | |||
与Sham组比较，I/R组心肌组织SOD、GSH-Px活性明显下降，而脂质过氧化代谢产物MDA含量明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.01)。与I/R组比较，异可利定各剂量组与维拉帕米组均能不同程度升高心肌组织SOD、GSH-Px活性，而降低脂质过氧化代谢产物MDA含量，差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。见Tab 3。
| Group | Dose/ mg·kg-1 | SOD/ kU·g-1 Pro | GSH-Px/ kU·g-1 Pro | MDA/ μmol·g-1 Pro |
| Sham | - | 264.65±61.62 | 567.73±49.65 | 2.00±0.36 |
| I/R | - | 147.15±32.76## | 344.19±101.60## | 3.09±0.70## |
| Verapamil | 2.5 | 191.18±58.45* | 424.69±23.37 | 2.22±0.34* |
| Isocorydine | 2.5 | 220.87±34.80** | 496.91±63.54* | 2.41±0.14* |
| 5.0 | 176.92±31.63 | 506.03±99.46* | 2.11±0.33** | |
| 10.0 | 169.77±28.92 | 497.25±87.14* | 2.54±0.29* | |
| *P＜0.05，**P＜0.01 vs I/R；##P＜0.01 vs sham | ||||
心肌缺血/再灌注损伤过程中，由于产生大量的氧自由基和细胞内Ca2+超载，从而使清除氧自由基的酶，SOD活性及GSH-Px活性降低，导致氧自由基的堆积，膜脂质过氧化物产物MDA含量增多，加重了心肌细胞的伤害，造成膜生物电不稳定性[13-14]。实验表明，异可利定能明显地推迟缺血/再灌注心律失常发生的时间，并缩短心律失常的持续时间，还能降低室性VE、VT及VF的发生率，使心肌组织中SOD活性及GSH-Px活性明显升高，降低膜脂质过氧化物产物MDA含量，与I/R组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。在抑制大鼠缺血/再灌注诱发心律失常的发生率，减轻再灌注造成的心肌损伤同时，还能降低心肌缺血面积及梗死范围，其机制可能与抗氧自由基与增加内源性氧自由基清除力，减轻脂质过氧化，维持细胞膜的正常通透性，减少酶的释放有关，从而达到抗心律失常，保护心肌损伤的效应。
综上所述，异可利定可抑制氧自由基介导的心肌细胞膜损害，稳定细胞膜的完整性，阻止细胞内、外离子分布异常，稳定心肌细胞的自律性，从而达到保护心肌、稳定心律、降低再灌注性心律失常的作用。
今后还可以继续研究该类生物碱变化多样的结构与活性，研究该类生物碱的抗心律失常作用构效关系，对先导化合物进行结构修饰等研究。寻找高效、低毒并具有多通道阻滞机制的药物，不仅符合目前抗心律失常药物的研究方向，也是中药现代化、国际化的研究方向，即对已知活性的天然产物进行结构修饰，开发寻找新药。
( 致谢: 本实验在云南中医学院药剂实验室完成，衷心感谢机能实验室杨瑜青老师的帮助与支持，感谢实验室同学们的帮助和鼓励！ )
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