由于抗生素的不合理应用甚至滥用，导致产生了比较严重的耐药问题。该问题已成为目前全球最紧迫的公共卫生挑战之一[1-4]。开发新型化学结构和机制的高效抗菌药物，已是目前公认的解决耐药性问题的主要途径。金属配合物类药物曾被人们应用于疾病诊疗[4, 9-10]，其中多吡啶钌配合物由于具有良好的热力学稳定性，光物理、光化学活性等，近年来越来越受到人们的关注。由于多吡啶钌配合物有较好的DNA结合能力，能够与之结合阻止DNA的复制、合成，甚至于直接破坏DNA，我们及同行在对其抗肿瘤方面进行了深入的研究[5-10]。然而，目前尚缺乏对这类配合物，尤其是单核的多吡啶钌配合物，在抗微生物方面的研究。本研究将在以往的基础上，证明多吡啶钌配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2的抗菌活性，这将更大地扩宽该配合物的应用。
据Barton等[12-13]报道，多吡啶钌配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2具有较好的DNA结合能力，其机制是通过与DNA结构中的小沟槽进行结合，并且插入DNA链的骨架中，产生对于DNA结构的破坏。以此为切入点，我们通过计算机模拟后，推测该配合物也能够较好地与细菌DNA结合，并达到抑菌效果，见Fig 1。本实验通过肉汤稀释法验证了配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2的抑菌活性，利用荧光显微镜确定配合物在细菌内的代谢情况，然后采用荧光分光光度法以及凝胶电泳的方法，测定和观察该配合物与细菌DNA的结合情况，以阐明其抗菌活性的机制。
|
| Fig 1 The computer imitation image of two hexafluoro-phosphate counterions are omitted for clarity A:Chemical structure of[(Phen)2Ru(dppz)];B:The insertion situation of complex and DNA,which analyzed by computer simulation |
YXQ-LS-50高压蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，SW-CJ系列超净工作台(安泰公司)，F2500荧光分光光度仪(HITACHI)，TGL-16M高速台式冷冻离心机(湘仪仪器有限公司)，AB135-S 电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，HE33小型水平电泳槽(Hoefer)，DYY-10C电泳仪(北京六一仪器厂)，ChemiDoc MP凝胶成像仪器(Bio-rad)。
1.1.2 试剂根据文献合成多吡啶钌配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2[14]，细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生物有限公司)，核酸染料Gold View(天根生物有限公司)。
1.1.3 实验细菌大肠杆菌标准菌株(Escherichia coli ATCC35218)、金黄色葡萄球菌标准菌株(Staphylocccus aureus ATCC25923)，购于重庆药检所。以上菌种均使用肉汤培养基(Luria-Bertani，LB培养基)。
1.2 方法 1.2.1 配合物最小抑菌、杀菌浓度(MIC/MBC)测定本实验中各配合物的抑菌活性，按照文献[3]，通过肉汤稀释法实验进行测定。最小杀菌浓度(MBC)测定，按照文献[3]中方法进行。
1.2.2 配合物在细菌菌体内代谢活性观察将1 mL隔夜培养的大肠杆菌菌液，与1 μL配合物(40 g·L-1)共同孵育2 h后，使用无菌生理盐水进行3次以上清洗以及离心。将菌体稀释后置于载玻片上，于荧光显微镜下以16倍数进行观察，以观察配合物是否进入细菌菌体内部产生荧光。
1.2.3 配合物与DNA结合能力测定将大肠杆菌DNA提取出来，与0.1 g·L-1的配合物进行孵育。大肠杆菌基因组DNA浓度分别为0~0.2 g·L-1。配合物与DNA的孵育条件为：37℃水浴1 h。然后，以荧光分光光度仪对其进行测定。测定条件为：吸收波长为400 nm，发射波长为587 nm。记录测定结果，以观察配合物与DNA结合情况。
为了进一步证明各配合物与细菌DNA的结合能力，测定其是否与核酸染料Gold View产生对于DNA的竞争性结合。在本实验中，我们将400 μL大肠杆菌DNA溶液与2 μL核酸染料Gold View事先进行孵育结合，再逐渐加入不同浓度配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2(0、0.1、0.2、0.4 g·L-1)，37 ℃孵育1 h。接着使用荧光分光光度仪进行测定和结果记录。
1.2.4 配合物与DNA结合效果的测定凝胶薄层电泳是一种常用的分析DNA片段的方法。同样，也能够通过DNA电泳产生的拖尾、条带消失等现象，观察到由于这种配合物的结合而产生的DNA损伤以及降解作用[15]。将大肠杆菌DNA提取出来备用。取浓度为0.4 g·L-1的配合物DMSO溶液4、2、1、0 μL分别加至DNA溶液中，合并为20 μL，然后于37 ℃水浴1 h。结束后，以未经处理过的大肠杆菌DNA为对照组进行电泳，接着以凝胶成像仪对结果进行观察记录。
2 结果 2.1 体外抗菌活性配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2的体外抑菌活性经过MIC及MBC实验测定后，结果如Fig 2所示。结果表明，配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2对革兰阴性菌大肠杆菌以及革兰阳性菌金黄色葡萄球菌均具有较好的抑菌以及杀菌活性。对于大肠杆菌来说，最小抑菌浓度为0.2 g·L-1，最小灭菌浓度为0.3 g·L-1。对于金黄色葡萄球菌来说，最小抑菌浓度为0.4 g·L-1，最小灭菌浓度为0.6 g·L-1。而且经过多次实验后发现，配合物对于大肠杆菌的抗菌效果要普遍优于金黄色葡萄球菌。
|
| Fig 2 MIC and MBC value of[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2 on different kinds of bacteria |
为了研究配合物在细菌菌体内部产生抑制作用的机制，首先应对配合物在细菌菌体内的代谢活性进行研究。将大肠杆菌隔夜培养后，与配合物在37 ℃下共同孵育2 h，通过荧光显微镜对细菌菌体进行观察，见Fig 3。在显微镜下，培养的大肠杆菌呈椭球形。加入配合物并孵育后，荧光显微镜下菌体内呈现红色荧光，而培养基中无明显荧光出现，表明配合物可快速进入菌体，并在菌体内浓集，为进一步探讨配合物与细菌DNA结合情况提供实验基础。
|
| Fig 3 Fluorescent image of E.coli after incubation with compoundfor 2 h observed by fluorescent microscope (magnification×16) A:The image of bacteria taken for a fluorescent picture;B:The image of bacteria taken in the white light;C:The merged image of these two pictures |
由于配合物能够进入细菌菌体并进行富集，因而直接提取大肠杆菌DNA并与配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2孵育1 h。随着DNA浓度升高，配合物荧光强度明显下降，见Fig 4。说明该配合物可能与DNA进行结合后发生电子转移，从而造成荧光强度的减弱。但是由于各配合物结构存在差异，也存在随DNA浓度增加，荧光强度上升的情况[15,17]。因而需要进一步的实验对其结合情况进行验证。
|
| Fig 4 The emission spectra of complex [(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2 that combined with E.coli genome DNA added in different concentrations |
由于多吡啶钌配合物之间存在结构差异，与DNA结合后，荧光强度增加或者减少的趋势不同。不能够单纯凭借上一实验数据判断配合物是否与DNA发生了结合，因而为进一步对结合情况进行研究，将已经与核酸染料Gold View发生结合的大肠杆菌DNA与配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2再次进行孵育，结果见Fig 5。通过Fig 5可以发现，随着配合物的逐渐加入，核酸染料Gold View的荧光强度逐渐减弱。由于核酸染料仅在与DNA结合后才能够产生荧光，因而通过其荧光强度的减弱可以说明核酸染料与DNA的结合被加入的配合物竞争性取代。通过配合物与核酸染料的竞争性结合可以进一步证明配合物与DNA发生了结合。
|
| Fig 5 Emission spectra of different concentrations of complex[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2 after combined with mixed system of Gold View and DNA from E.coli |
经过以上的实验可以得出配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2能够与DNA发生较好的结合。而从计算机模拟结果可知该配合物具有能够嵌入DNA双链结构内部的能力[9]，从而对DNA造成破坏，形成抑菌的作用。因而需要进一步进行凝胶电泳，直观地观察配合物与DNA结合的状况。如Fig 6所示，配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2与DNA结合效果明显。b、c组分别含有浓度为2 g·L-1以及1 g·L-1配合物，d组为37 ℃水浴1 h未加入配合物的DNA组。从结果可以观察到，由于配合物对DNA的切割降解作用，未能够产生明显的DNA条带。而未加入配合物仅在同样条件下孵育的DNA未产生降解效果，说明配合物能够通过嵌入DNA双链内部造成DNA的破坏。
|
| Fig 6 Gel electrophoresis of DNA combined with different concentrations of complex[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2 a:Marker;b~d:DNA combined with complex[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2 with different concentrations; e:Blank group,DNA with no treatment |
多吡啶钌配合物具有较好的生物活性，近年来在抗肿瘤方面的研究较多。虽然在多年以前Dwyer等[11]就对其抑菌活性以及细胞毒性做过报道，但是对于其产生抑菌活性的机制却没有进行详细的研究。最近有文献报道，多吡啶钌配合物能够与DNA结合抑制癌细胞生长[16]。因而，本实验以此为切入点，进行多吡啶钌配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2对于细菌DNA的结合能力研究，以探讨该配合物的抑菌机制。
本文实验结果，经肉汤稀释法测定多吡啶钌配合物抑菌效果较为理想，最小抑菌浓度为0.4 g·L-1。通过荧光显微镜观察后，能够看见细菌菌体内明显的荧光，说明该配合物确实进入细菌菌体内部，拥有与菌体内生物大分子进行结合的可能性。通过荧光强度测定后发现，配合物与DNA结合后其荧光强度随DNA浓度提高呈下降趋势，推测该配合物能够与DNA发生结合。利用该配合物与核酸染料竞争性结合DNA后测定发现，随着该配合物的浓度增加，核酸染料的荧光强度明显下降，证明该配合物确实存在和DNA结合的能力，其结合强度高于核酸染料。最后通过凝胶电泳观察到配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2不仅能够与DNA进行结合，还能够嵌入DNA分子内，并造成切割降解作用。因此，我们认为配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2与该类配合物抗癌机制相似，可以与细菌DNA结合后产生对于DNA的降解作用，从而达到较好的抑菌效果。
通过本实验，对新型单核多吡啶钌配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2的抑菌活性以及机制进行了研究和探讨，这有助于对多吡啶钌类抑菌配合物的开发，并且对研究和设计类似配合物起到了理论指导和参考作用。然而，该化合物的应用仍然存在着一定的限制，如该配合物在不同菌种间(包括耐药菌)产生的抑菌活性差异，该配合物对于细菌内其他生物大分子的作用机制，以及该配合物对于真核细胞以及原核细胞DNA是否具有差异性等都有待进一步研究。
| [1] | Béguin P, Millet J, Chauvaux S, et al. Bacterial cellulases[J]. Biochem Soc Trans, 1992, 20 (1) : 42-6 doi:10.1042/bst0200042. |
| [2] | Deurenberg R H, Stobberingh E E. The evolution of Staphylococcus aureus[J]. Infect Genet Evol, 2008, 8 (6) : 747-63 doi:10.1016/j.meegid.2008.07.007. |
| [3] | Yang X F, Zhou Z B. In vitro release and antibacterial activity of poly(oleic/linoleic acid dimer:sebacic acid)-gentamicin[J]. Acta Pharmacol Sin, 2003, 24 (4) : 306-10 . |
| [4] | 郑喜, 李国红, 王芯, 等. 昆明山海棠内生真菌ThF11化学成分抗菌杀线虫作用的研究[J]. 中国药理学通报, 2014, 30 (12) : 1709-13 . Zhen X, Li G H, Wang X, et al. Antibacterial and nematicidal activity of endophyte ThF-11 of Tripterygium hypoglaucum(Levl.)Hutch[J]. Chin Pharmacol Bull, 2014, 30 (12) : 1709-13 . |
| [5] | Harder H C, Rosenberg B. Inhibitory effects of anti-tumor platinum compounds on DNA, RNA and protein syntheses in mammalian cells in vitro[J]. Int J Cancer, 1970, 6 (2) : 207-16 doi:10.1002/(ISSN)1097-0215. |
| [6] | Jun Y J, Kim J I, Jun M, et al. Selective tumor targeting by enhanced permeability and retention effect synthesis and antitumor activity of polyphosphazene-platinum(Ⅱ) conjugate[J]. Inorg Biochem, 2005, 99 (8) : 1593-601 doi:10.1016/j.jinorgbio.2005.04.019. |
| [7] | Xiang Y, Fu C, Breiding T, et al. Hydrolytically stable octahedral silicon complexes as bioactive scaffolds: application to the design of DNA intercalators[J]. Chem Commun(Camb), 2012, 48 (57) : 7131-3 doi:10.1039/c2cc32506c. |
| [8] | Chen F, Marianne W, Elisabeth T, et al. Proline as chiral auxiliary for the economical asymmetric synthesis of ruthenium(II) polypyridyl complexes[J]. Inorg Chem, 2012, 51 (18) : 10004-11 doi:10.1021/ic3015157. |
| [9] | 唐丽娟, 钟雪云, 林琛莅, 等. 新型糖原合成激酶-3β抑制剂——多吡啶钌配合物的抗肿瘤研究[J]. 中国药理学通报, 2010, 26 (10) : 1296-300 . Tang L J, Zhong X Y, Lin C L, et al. Research in anti-tumor activity of the novel GSK-3β inhibitor-polypyridyl ruthenium complexes[J]. Chin Pharmacol Bull, 2010, 26 (10) : 1296-300 . |
| [10] | Lebwohl D, Canetta R. Clinical development of platinum complexes in cancer therapy: an historical perspective and an update[J]. Eur J Cancer, 1998, 34 (10) : 1522-34 doi:10.1016/S0959-8049(98)00224-X. |
| [11] | Dwyer F P, Gyarfas E C, Rogers W P, et al. Biological activity of complex ions[J]. Nature, 1952, 170 (170) : 190-1 . |
| [12] | Komor A C, Barton J K. The path for metal complexes to a DNA target[J]. Chem Commun(Camb), 2013, 49 (35) : 3617-30 doi:10.1039/c3cc00177f. |
| [13] | Basile L A, Raphael A L, Barton J K. Metal-activated hydrolytic cleavage of DNA[J]. J Am Chem Soc, 2002, 109 (24) : 7550-1 . |
| [14] | Cook N P, Kilpatrick K, Segatori L, et al. Detection of α-synuclein amyloidogenic aggregates in vitro and in cells using light-switching dipyridophenazine ruthenium(Ⅱ) complexes[J]. J Am Chem Soc, 2012, 134 (51) : 20776-82 doi:10.1021/ja3100287. |
| [15] | Sun D, Zhang W, Lv M, et al. Antibacterial activity of ruthenium(Ⅱ) polypyridyl complex manipulated by membrane permeability and cell morphology[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2015, 25 (10) : 2068-73 doi:10.1016/j.bmcl.2015.03.090. |
| [16] | Pages B J, Ang D L, Wright E P, et al. Metal complex interactions with DNA[J]. Dalton Trans, 2015, 44 (8) : 3505-26 doi:10.1039/C4DT02700K. |