随着社会发展，饮酒成为人类的一种生活习惯，白酒、啤酒、红酒、香槟等不仅影响了人们的生活，更影响了健康。饮酒时乙醇首先经胃吸收入血，其在胃平滑肌中的浓度高于血中的浓度[1]，故对胃肠道的影响更为常见。乙醇可直接损害胃黏膜[2]，体积分数为0.75浓度的乙醇灌胃引起小鼠胃黏膜上皮细胞不同程度地变性、坏死[3]。小鼠离体胃平滑肌条即使暴露于体积分数为0.007 5浓度的乙醇，也可诱发细胞外钙内流和内钙释放，使肌条产生收缩反应[4]。在清醒犬测定胃和十二指肠收缩反应的实验中，犬进餐后灌流体积分数为0.3浓度的乙醇时，胃及十二指肠的收缩活动受到明显抑制[5]。人体试验发现，嗜酒者出现胃动过缓和胃排空障碍[6]；嗜酒者及社交饮酒者的口-盲肠传递时间明显长于禁酒者，提示乙醇对消化道平滑肌具有毒性作用[7]。Stermer[8]认为高浓度乙醇抑制胃排空，产生胃胀满感甚至恶心；此外，少量或大量饮酒均可造成食管下括约肌松弛，诱发胃-食管返流而引起烧心等症状。据报道，人饮用红酒或啤酒以及相应浓度的乙醇溶液(4%或10%)，均可使固体食物的胃排空延迟，其中红酒的作用甚至强于同浓度乙醇[9]。
多数观点认为，固体食物的胃排空主要由远端胃调控，而液体食物的胃排空主要由近端胃调控[10]；但是也有完全相反的研究报道[11]。最近，本课题组建立了大鼠离体胃底、胃体、胃窦、贲门和幽门环行肌的药理学实验方法，并探索了毒蕈碱(M)受体及5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)受体介导胃平滑肌收缩的药理学特征[12]。众所周知，胃肠道系统的M受体与5-HT受体含量丰富，这些受体对胃肠功能具有重要的调控作用[13]。但是乙醇对大鼠离体胃底、胃体、贲门和幽门环行肌的作用尚不清楚。本研究中，我们以卡巴胆碱(carbachol，CCh)和5-HT作为胃平滑肌收缩功能的特异性受体激动剂，在大鼠离体胃底、胃体、贲门和幽门环行肌标本上，分析乙醇对M受体以及5-HT受体介导收缩反应的影响。
1 实验材料 1.1 仪器PowerLab 8/35型数据采集系统(包括Octal Bridge Amp及MLT0380/D型张力换能器)，澳大利亚AD Instruments Pty Ltd公司产品；7146型Nanopur纯水仪，美国Thermo公司；CP213型电子天平，美国Ohaus Corporation公司；LGY-2型冷光源，大悦维佳(北京)科技有限公司；50 μl微量进样器，上海安亭仪器厂。
1.2 试剂卡巴胆碱(carbachol，CCh)，ABCR GmbH＆Co KG公司。五羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)Kasei Kogyo Co Ltd公司。NaCl、KCl、MgSO4、NaHCO3、NaH2PO4、CaCl2与glucose均购自美国Sigma-Aldrich公司。CCh或5-HT以去离子水(溶媒)配制成一定浓度的母液，将母液储存于棕色瓶中，置-20℃冰箱内备用。
1.3 动物Wistar大鼠，清洁级，♂，每只体质量300~350 g，由河北省实验动物中心提供，饲料亦由该中心提供。大鼠饲养于室温：23℃±1℃，相对湿度：(50±5)%，明暗各12 h(光照时间8 ∶00~20 ∶00)的动物饲养室内。自由饮食、饮水。大鼠在该环境下适应性饲养3 d，并于实验前12 h禁食。
2 方法 2.1 营养液配制改良K-H(Krebs-Henseleit)液的成份为(mmol·L-1)[14-15]：NaCl 133、KCl 4.7、MgSO4 0.61、NaH2PO4 1.35、CaCl2 2.52、NaHCO3 16.3、glucose 7.8。除NaHCO3、CaCl2和glucose于实验前临时加入外，其他成份均配成高浓度母液。实验当日，取适量的各母液，加入超纯水，稀释至所需浓度。配制好的营养液用盐酸调pH至7.2~7.4，以95% O2和5% CO2的混合气体充分预饱和后备用。
2.2 离体胃平滑肌标本制备以乌拉坦1.5 g·kg-1皮下注射麻醉大鼠后，经颈动脉放血处死，迅速取出全胃。沿胃大弯剪开，并在95% O2和5% CO2混合气预先饱和的4℃改良K-H液中漂洗干净。将胃固定于盛有石蜡的培养皿中，培养皿内充满改良K-H液。分别沿环行肌纤维的方向切取腹侧胃底环行肌、胃体环行肌、贲门环行肌和幽门环行肌四个部位的标本[12, 16-17]。每只大鼠取胃底环行肌2条、胃体环行肌2条以及贲门和幽门环行肌各1条，标本长8 mm宽2 mm。以眼科剪仔细剪除黏膜后，标本两端用丝线打结，一端固定于金属支架，另一端经丝线连接于张力换能器；标本置于含有改良K-H液的浴槽中，温度维持在(37±0.5)℃。胃底、胃体、贲门和幽门环行肌分别施以2 g前负荷[12]，平衡1 h(每15 min换1次K-H液)，待标本收缩活动稳定后开始实验。
2.3 实验设计在M受体介导的胃平滑肌收缩实验中，采用累积给药法观察CCh(0.001~30 μmol·L-1)诱发的胃底、胃体、贲门和幽门环行肌收缩反应(g)。每个标本均建立4轮CCh(0.001~30 μmol·L-1)诱发的浓度-收缩反应曲线；其中第1轮作为标本的自身对照，反复冲洗标本并休息50 min后，建立下一轮CCh诱发的浓度-收缩反应曲线。在后3轮实验中，给予CCh前20 min，标本浴槽中分别顺序加入终浓度是体积分数为0.000 05、0.000 1和0.000 5的乙醇，预处理20 min后观察CCh(0.001~30 μmol·L-1)诱发收缩反应的变化。
在5-HT受体介导的胃平滑肌收缩实验中，采用累积给药法观察5-HT(0.000 1~30 μmol·L-1)诱发的胃底、胃体和贲门环行肌收缩反应(g)。在贲门环行肌标本，建立4轮5-HT(0.000 1~30 μmol·L-1)诱发的浓度-收缩反应曲线；其中第1轮作为标本的自身对照，反复冲洗标本并休息50 min后，建立下1轮5-HT诱发的浓度-收缩反应曲线。在后3轮实验中，给予5-HT前20 min，标本浴槽中分别顺序加入终浓度是体积分数为0.000 05、0.000 1和0.000 5的乙醇，预处理20 min后观察5-HT(0.000 1~30 μmol·L-1)诱发收缩反应的变化。对于胃底和胃体环行肌标本，仅能建立两轮5-HT(0.000 1~30 μmol·L-1)诱发的浓度-收缩反应曲线；其中第1轮作为标本的自身对照，反复冲洗标本并休息50 min后，建立第2轮5-HT诱发的浓度-收缩反应曲线；在给予第2轮5-HT前20 min，标本浴槽中加入终浓度是体积分数为0.000 5的乙醇。
2.4 数据分析与统计学处理药物诱发的收缩反应以实测值(g)的x±s表示。采用加权回归法计算药物诱发浓度-收缩曲线的Emax值以及-lgEC50值。各组间Emax值或-lgEC50值的明显性检验，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及Dunnett's test。两条浓度-收缩曲线间的比较，采用双因素方差分析(two-way ANOVA)，当F值有明显性(P<0.05)时，进一步采用Bonferroni′s test，比较两对应浓度之间的差异。统计分析及图形处理使用GraphPad Prism 5.0软件(San Diego California USA)。
3 结果 3.1 乙醇对CCh诱发大鼠胃底和胃体环行肌收缩的影响如Fig 1A及1C所示，在溶媒对照组大鼠的胃底和胃体环行肌标本上，CCh(0.001~30 μmol·L-1)可诱发浓度依赖性收缩反应，3次给予溶媒均未对CCh诱发的肌条收缩反应产生明显影响(P>0.05)。在乙醇处理组大鼠标本上(Fig 1B及1D)，乙醇处理前胃底和胃体环行肌的Emax值(g)分别是10.32±0.33和12.18±0.33，-lgEC50值(mol·L-1)分别是6.58±0.06和6.33±0.05；体积分数为0.000 05~0.000 5乙醇预处理不影响CCh诱发的胃底环行肌收缩反应(P>0.05)。但是体积分数为0.000 1和0.000 5浓度的乙醇明显抑制了CCh诱发的胃体环行肌收缩(P<0.05，two-way ANOVA)，其中Emax值(g)最大降至10.88±0.41，-lgEC50值(mol·L-1)最大降至6.12±0.06(P<0.05，Fig 1D)。
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| Fig 1 Effects of ethanol on contractile responses to carbachol(0.001~30 μmol·L-1) in isolated circular muscle strips of the rat gastric fundus(A and B) and gastric body(C and D)(x±s,n=7) *P<0.05,**P<0.01 vs control |
在溶媒对照组大鼠的胃贲门和幽门环行肌标本上(Fig 2A及2C)，CCh(0.001~30 μmol·L-1)可诱发浓度依赖性收缩反应，3次给予溶媒均未对CCh诱发的肌条收缩反应产生明显影响(P>0.05)。在乙醇处理组大鼠标本上(Fig 2B及2D)，乙醇处理前贲门和幽门环行肌的Emax值(g)分别是8.34±0.27和2.87±0.15，-lgEC50值(mol·L-1)分别是6.45±0.06和6.49±0.10；体积分数为0.000 05~0.000 5乙醇预处理不影响CCh诱发的贲门环行肌收缩反应(P>0.05)。但是体积分数为0.000 1和0.000 5浓度的乙醇明显抑制了CCh诱发的幽门环行肌收缩(P<0.05，two-way ANOVA)，其中Emax值(g)最大降至2.2±0.13，-lgEC50值(mol·L-1)最大降至6.05±0.09(P<0.01，Fig 2D)。
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| Fig 2 Effects of ethanol on contractile responses to carbachol(0.001-30 μmol·L-1) in isolated circular muscle strips of the rat gastric cardia(A and B,n=6) and gastric pylorus(C,n=6; D,n=7) x±s,*P<0.05,**P<0.01 vs control |
如Fig 3A及3C所示，在溶媒对照组大鼠的胃底和胃体环行肌标本上，5-HT(0.000 1~30 μmol·L-1)可诱发浓度依赖性收缩反应，给予溶媒后5-HT诱发的肌条收缩反应产生无明显改变(P>0.05)。在乙醇处理组大鼠标本上(Fig 3B及3D)，乙醇处理前胃底和胃体环行肌的Emax值(g)分别是4.47±0.43和4.11±0.32，-lgEC50值(mol·L-1)分别是7.34±0.26和6.83±0.18；体积分数为0.000 5浓度的乙醇预处理标本后，5-HT诱发的胃底和胃体环行肌收缩反应未发生明显改变(P>0.05)。
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| Fig 3 Effects of ethanol on contractile responses to 5-HT(0.000 1~30 μmol·L-1) in isolated circular muscle stripsof the rat gastric fundus(A,n=8; B,n=6) and gastric body(C,n=7; D,n=6)(x±s) |
在溶媒对照组大鼠的胃贲门环行肌标本上(Fig 4A)，5-HT(0.000 1~30 μmol·L-1)可诱发浓度依赖性收缩反应，3次给予溶媒均未对5-HT诱发的肌条收缩反应产生明显影响(P>0.05)。在乙醇处理组大鼠标本上(Fig 4B)，乙醇处理前贲门环行肌的Emax值(g)是2.93±0.35，-lgEC50值(mol·L-1)是6.17±0.21；体积分数为0.000 1和0.000 5浓度的乙醇明显抑制了5-HT诱发的贲门环行肌收缩(P<0.05，two-way ANOVA)，其Emax值(g)最大降至2.1±0.30(P<0.05)，但是5-HT 的-lgEC50值未受乙醇影响(P>0.05)。
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| Fig 4 Effects of ethanol on contractile responses to 5-HT (0.000 1~30 μmol·L-1) in isolated circular muscle stripsof the rat gastric cardia(A,n=6; B,n=8)(x±s) *P<0.05 vs control |
功能性M受体包括M1、M2和M3 3种亚型，M2和M3受体均介导大鼠胃平滑肌收缩反应，其中以M3受体为主[17]。本研究中，环行肌标本未经乙醇处理前，CCh诱发大鼠离体胃底、胃体、贲门和幽门收缩的pD2值分别为6.58±0.06、6.33±0.05、6.45±0.06和6.49±0.10，数值十分接近；表明大鼠胃底、胃体、贲门和幽门环行肌中，介导CCh诱发收缩反应的M受体亚型基本相同。本研究发现，与乙醇处理前相比，体积分数为0.000 5乙醇明显抑制了大鼠胃体和幽门环行肌CCh诱发的收缩反应，两种标本的Emax值分别降低了11%和23%。同时体积分数为0.000 5浓度的乙醇明显升高了大鼠胃体和幽门环行肌CCh诱发收缩的EC50值，分别升高了2.2倍和4.4倍。研究结果提示，乙醇不仅降低了CCh收缩胃体和幽门环行肌的活力，而且抑制CCh与胃体和幽门环行肌M受体的亲和力。但是，该浓度乙醇对胃底和贲门环行肌CCh的收缩反应无影响。既然大鼠胃底和贲门环行肌中介导CCh诱发收缩反应的M受体亚型与胃体和幽门相似，我们尚不清楚为何体积分数为0.000 5浓度的乙醇的抑制作用具有胃解剖学(胃的不同区域)上的差异。
未经乙醇处理前，5-HT诱发大鼠离体胃底、胃体和贲门环行肌收缩的pD2值分别为7.34±0.26、6.83±0.18和6.17±0.21，其中胃底环行肌的pD2值明显大于贲门环行肌。显然大鼠胃贲门环行肌中，介导5-HT诱发收缩反应的5-HT受体亚型不同于胃底和胃体。进一步研究发现，与乙醇处理前相比，体积分数为0.000 5的乙醇明显抑制了大鼠贲门环行肌5-HT诱发的收缩反应，Emax值降低了28%。与上述抑制CCh的作用方式不同，乙醇不改变5-HT诱发贲门环行肌收缩的pD2值，即不影响5-HT与胃贲门环行肌5-HT受体的亲和力。此外，乙醇对5-HT受体介导的胃底和胃体环行肌收缩反应无明显影响。考虑到5-HT在胃贲门环行肌诱发收缩的EC50值高于胃底环行肌10倍以上，显然今后的工作应该重点分析贲门与胃底环行肌上5-HT受体亚型的差异性分布以及乙醇是否对某种5-HT受体亚型具有选择性抑制作用。
虽然胃排空与人胃体、胃底、胃窦、贲门以及幽门平滑肌功能的相关性仍存争议，但是一般观点认为固体食物的胃排空主要由远端胃调控，而液体食物的胃排空主要由近端胃调控[10]。已经证实，少量或大量饮酒造成人食管下括约肌松弛，引发胃-食管返流[8]。饮用含乙醇的饮料、红酒或啤酒均可导致固体食物的胃排空延迟[9]。目前，大鼠胃不同区域平滑肌的活动与胃排空的关系尚不十分清楚，但是本研究发现体积分数为0.000 5浓度的乙醇选择性抑制了大鼠胃贲门环行肌5-HT诱发的收缩反应，且抑制作用最强。这种选择性抑制作用是否与乙醇诱发胃-食管返流的病理基础相一致，仍需临床进一步研究。总之，本研究证实了乙醇对大鼠胃不同区域环行肌具有选择性抑制作用，4种组织中仅胃底环行肌的收缩未受乙醇的影响；乙醇对其他3种环行肌收缩反应的抑制强度分别是：乙醇仅抑制5-HT诱发的贲门收缩，对CCh诱发收缩的抑制强度为幽门大于胃体。此外，从受体药理学角度分析，乙醇对胃环行肌的抑制方式也存在差异。对于5-HT受体介导的收缩，乙醇不仅抑制激动剂的活性，也同时抑制激动剂的亲和力；对于CCh受体介导的收缩，乙醇仅抑制激动剂的活性。
( 致谢: 本研究的所有工作均在河北医科大学中西医结合学院的中西医结合研究所进行。任雷鸣教授设计并指导实验研究，许文琪、张贺飞、都倩、赵静、夏红月完成实验，任雷鸣、许文琪、夏红月书写论文。 )
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