2. 暨南大学 医学院药理学系,广东 广州 510632;
3. 暨南大学 医学院生理学系，广东 广州 510632;
4. 广东省中医院病理科，广东 广州 510120
2. Dept of Pharmacology，Medical College，Guangzhou 510632，China ;
3. Dept of Physiology，Medical College，Jinan University，Guangzhou 510632，China ;
4. Dept of Pathology，Guangdong Hospital of Chinese Medicine，Guangzhou 510120，China
鼻咽癌是一种鼻咽部的鳞状上皮细胞癌，临床上具有发病部位较深、病变难以被早期发现，以至就诊时许多病人已是中晚期，且癌变后易发生侵润转移的特点[1]。目前临床治疗以放疗联合辅助化疗为主，尽管联合放化疗可以提高鼻咽癌的局控率和生存率，但是两种手段对正常细胞均有明显的毒性作用，化疗后患者常出现骨髓抑制、胃肠功能紊乱等不良反应，或者由于照射剂量过大，导致邻近高危区域损伤，严重影响患者的预后[2]。
双硫仑(disulfiram，DSF)是一种在临床使用了60年的抗酗酒药物，是能够抑制醇脱氢酶的二硫代氨基甲酸盐药物，具有安全性好、低毒且价格低廉的特性[3]。近年来研究显示，DSF对乳腺癌、白血病、黑色素瘤及结肠癌等多种肿瘤细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用，并能增强顺铂等化疗药物对癌细胞的化学敏感性[4-5]。进一步研究还表明，DSF螯合Cu2+可以明显增强DSF对肿瘤细胞的杀伤作用，同时赦免正常细胞[6]，但关于其对鼻咽癌作用的相关报道较少，且其具体的抗肿瘤分子机制也尚未阐明。
原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)成像是一种新型的具有纳米级分辨率的表面成像技术，具有分辨率高、样品制备简单、可在近生理环境下直接观测生物样品等优点，近来被广泛应用于生命科学领域的研究[7-8]。
本实验通过AFM 观察DSF-Cu诱导CNE-2Z 细胞形貌及超微结构的变化，旨在探讨DSF-Cu对人低分化鼻咽癌细胞的抗肿瘤作用的分子机制，及提供微观形态学参考，为临床治疗鼻咽癌提供实验依据。
1 材料与试剂 1.1 主要试剂双硫仑购自Sigma-Aldrich，经DMSO 溶解并稀释成2 mmol·L-1储存液，分装，-20 ℃保存，临用前用无菌PBS稀释成所需工作液浓度。氯化铜(copper chloride)购自Sigma-Aldrich；RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青霉素、链霉素均购自Gibco公司。Annexin V-FITC/PI apoptosis detection Kit(BMS500FI)购自eBioscience；Rhodamine Phalloidin(PHDG1-A)购自Cytoskeleton；PI/RNase Staining Buffer(550825) and Mitochondrial membrane potential JC-1 Detection Kit(551302)购自BD；2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)购自碧云天生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。细胞培养板、移液管、离心管、培养皿和培养瓶均为Corning产品。Falcon细胞过滤网为BD产品；无菌35 mm激光共聚焦专用培养皿为杭州生友生物技术有限公司产品；流式细胞仪(Coulter Gallios)为美国Beckman Coulter Gallios产品；激光扫描共聚焦显微镜(LSM 510 Duo Scan)为Carl Zeiss产品；原子力显微镜 ( BioScope Catalyst NanoScope-V ) 为Bruker 产品；倒置显微镜 (IX 51) 为Olympus产品。
1.2 细胞培养人鼻咽癌CNE-2Z细胞常规复苏后，在含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 kU·L-1链霉素的RPMI 1640培养基中进行培养，放在5% CO2、37 ℃的恒温孵箱中进行孵育。细胞贴壁生长，每隔2 d换液1次，当细胞长至70%～80%时，加0.25%胰酶消化传代，取对数生长期的细胞计数并用于实验。
1.3 检测DSF-Cu对CNE-2Z细胞周期的影响CNE-2Z 细胞接种于6孔板中，培养24 h后每孔分别加入含0、25、50、100、150和200 nmol·L-1 DSF-Cu的培养基2 mL，继续培养24 h。收集细胞与培养基于EP管内，1 000 r·min-1离心5 min，去除上层液体，PBS缓冲液重悬洗涤2次，加入1 mL 70%冷乙醇，于4 ℃固定过夜。1 000 r·min-1离心5 min，PBS缓冲液重悬洗涤2 次。每管样品各加入200 μL PI/RNase 染液充分混合并重悬细胞，37 ℃室温避光孵育15 min。 用Falcon细胞过滤网过滤细胞，上流式细胞仪检测，用激发波长488 nm，发射波长615 nm检测PI荧光信号。获取至少10 000个细胞，用MidFit软件分析细胞周期的分布。
1.4 AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率 收集各组细胞，1 200 r·min-1，离心5 min，PBS缓冲液重悬洗涤1次。将细胞重悬于200 μL binding buffer，再各加入5 μL Annexin V-FITC和PI染液，37 ℃室温避光孵育15 min后再用200 μL binding buffer重悬洗涤1次。最后加入200 μL binding buffer重悬，上流式细胞仪检测，用激发波长488 nm，发射波长525 nm和630 nm分别检测Annexin V-FITC和PI荧光信号。获取至少10 000个细胞，用Kaluza Analysis 1.3(Beckman Coulter，USA)软件分析。
1.5 检测DSF-Cu对CNE-2Z细胞活性氧生成的影响利用荧光染料DCFH-DA的荧光强度变化，定量检测细胞内活性氧水平。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。 进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。 而DCFH不会透过细胞膜，因此探针很容易被积聚在细胞内。细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，故DCF荧光强度与活性氧的水平成正比。收集各组细胞，1 200 r·min-1离心5 min，PBS缓冲液重悬洗涤1次后将细胞重悬于200 μL DCFH-DA染液，37 ℃室温避光孵育15 min后，再加入200 μL PBS缓冲液重悬洗涤1次。最后加入200 μL PBS缓冲液，混匀，上流式细胞仪检测，用激发波长488 nm，发射波长525 nm检测DCF荧光信号。获取至少10 000个细胞，用Kaluza Analysis 1.3(Beckman Coulter，USA) 软件分析。
1.6 检测DSF-Cu对CNE-2Z细胞线粒体膜电位电势的影响利用荧光探针JC-1检测CNE-2Z 细胞线粒体膜电位电势的改变，JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)的理想荧光探针，JC-1探针以电势依赖性的方式积聚在线粒体内。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于胞质中，产生绿色荧光。因此可以根据颜色的变化直接反映出线粒体膜电位的变化。加入不同浓度的DSF-Cu培养24 h后，胰酶消化及PBS重悬细胞，1 000 r·min-1离心5 min后，弃上清；加入200 μL JC-1染液，混匀，37℃避光孵育15 min；然后加入500 μL洗液重悬细胞，1 000 r·min-1离心5 min后，弃上清；加入200 μL洗液，混匀，上流式细胞仪检测，用激发波长488 nm，发射波长525 nm和590 nm分别检测JC-1 Green和JC-1 Red荧光信号。 获取至少10 000个细胞，用Kaluza Analysis 1.3(Beckman Coulter，USA)软件分析。
1.7 原子力显微镜成像观察将多聚赖氨酸浸泡消毒过的盖玻片置于6孔板中，按1×108·L-1接种CNE-2Z细胞，加入不同浓度的DCF-Cu孵育24 h后，用1%戊二醛固定细胞10 min，用超纯水洗涤细胞3次，自然晾干。实验采用150Al-G硅探针，微悬臂的弹性系数为2.8 N·m-1。将制备好的样品置于原子力显微镜的XY扫描台上，定位待扫描样品区域，采ScanAsyst mode成像，扫描区域50×50 μm2，扫描频率0.8 Hz，用AFM图像自带软件Nanoscope analysis software 8.14对扫描方向上出现的低频背景噪音做平滑处理。
1.8 激光扫描共聚焦显微镜检测CNE-2Z细胞F-actin结构调整CNE-2Z细胞悬液浓度至1×109·L-1，接种于无菌35 mm激光共聚焦专用培养皿，细胞贴壁培养24 h，每孔分别加入含0、25、50、100、150和200 nmol·L-1 DSF-Cu的培养基2 mL，继续培养24 h，吸去培养基，PBS缓冲液洗涤3次，用4%多聚甲醛固定细胞30 min后，用含0.5% Triton X-100的PBS缓冲液通透细胞5 min；用含有10%绵羊血清封闭30 min，然后每皿加入100 nmol·L-1 Rhodamine-phalloidin 50 μL，室温避光孵育30 min，PBS缓冲液洗涤3次后，加入Hoechst 33258染细胞核；最后用PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min，滴加抗淬灭剂后直接用LSM 510 Duo Scan laser scanning confocal microscope(Carl Zeiss)进行观察、拍照。用Aim Image Examiner Software分析处理图片。
1.9 统计学处理实验数据以x±s表示，采用SPSS 17.0进行统计学分析，多组间比较应用单因素方差分析，方差分析后两两比较采用两样本的t检验。
2 结果 2.1 DSF-Cu对CNE-2Z细胞周期的影响不同浓度25、50、100、150和200 nmol·L-1 DSF-Cu作用于CNE-2Z细胞24 h后，随药物浓度增加，CNE-2Z细胞处于G2/M期的比例，与对照组(9.91±0.68)%相比，实验组G2/M期细胞依次增加至：(13.89±1.91)%、(20.36±1.28)%、(24.21±1.19)%、(31.02±2.02)%和(35.40±1.70)%，而G0/G1期细胞比例则从对照组(50.94±0.71)%，逐渐降低至(46.89±1.71)%、(42.79±1.64)%、(39.82±1.49)%、(32.45±4.07)% 和(27.66±4.06)%，S期细胞比例无明显变化。差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，表明DSF-Cu将CNE-2Z细胞周期阻滞于G2/M期，有效抑制肿瘤细胞的增殖。见Fig 1。
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| 图 1 Cycle arrest of CNE-2Z cells after treated with different concentration of DSF-Cu for 24 h determined by flow cytometry *P<0.05，**P<0.01 vs control group |
为了进一步说明DSF-Cu对CNE-2Z 细胞的毒性作用，接下来利用Annexin-V/FITC双染法检测DSF-Cu诱导CNE-2Z 细胞凋亡。与对照组(0.33±0.12)%相比，随用药浓度的增加，CNE-2Z细胞早凋率依次增加至(0.58±0.12)%、(2.99±0.46)%、(5.43±1.26)%、(5.87±3.72)% 和(31.02±13.41)%；而晚凋和坏死率，对照组为(1.23±1.44)%，实验组依次增加至(1.13±0.85)%、(7.31±3.43)%、(16.39±5.49)%、(33.13±7.38)%和(51.92±8.27)%，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，表明DSF-Cu可显著诱导CNE-2Z细胞凋亡。见Fig 2。
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| 图 2 Apoptosis of CNE-2Z cells stained with Annexin V-FITC/PI after treated with different concentration of DSF-Cu for 24 h determined by flow cytometry *P<0.05，**P<0.01 vs control group |
利用DCFH-DA荧光探针检测不同浓度25、50、100、150和200 nmol·L-1 DSF-Cu作用于CNE-2Z细胞24 h后，细胞内活性氧水平的变化。随药物浓度的增加，与对照组DCF的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)13.01±5.27相比，实验组依次为12.06±4.19、17.30±6.14、29.85±10.25、38.49±13.44和49.80±15.83。实验组荧光峰值整体右移，细胞内ROS染料的荧光明显增强，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。表明DSF-Cu可促进CNE-2Z细胞内活性氧的水平的增加，在DSF-Cu 诱导凋亡的过程中发挥关键作用。见 Fig 3。
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| 图 3 Levels of ROS in CNE-2Z cells after treated with different concentration of DSF-Cu for 24 h determined by flow cytometry **P<0.01 vs control group |
以荧光探针JC-1检测MMP，并以绿色荧光的比例代表膜电位下降的比例。不同浓度25、50、100、150和200 nmol·L-1 DSF-Cu作用于CNE-2Z细胞24 h后，与对照组(0.71±0.38)%相比，实验组MMP下降的比例依次增加至(1.61±0.73)%、(7.96±2.55)%、(30.87±7.06)%、(65.46±12.44)%和(94.61±1.56)%，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。表明DSF-Cu可促进CNE-2Z细胞线粒体膜电位的明显下降，参与DSF-Cu 诱导细胞凋亡的过程。见Fig 4。
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| 图 4 Mitochondria-dependent apoptosis of CNE-2Z cells stained with JC-1 after treated with different concentration of DSF-Cu for 24 h determined by flow cytometry **P<0.01 vs control group |
用AFM 对对照组和作用不同浓度DSF-Cu实验组CNE-2Z细胞进行成像，发现细胞形态有明显变化。对照组细胞呈长梭形，胞体饱满，细胞表面布满颗粒状隆起，粗糙不平。从胞体伸出很多细丝状伪足，细胞与细胞之间通过丝状伪足紧密连接。经过低浓度50 nmol·L-1 DSF-Cu处理后，细胞发生皱缩、变圆，胞体边缘的丝状伪足部分回缩。随用药浓度增加至100 nmol·L-1，细胞形貌破坏加剧，尤其丝状伪足结构数量明显减少，细胞膜表面变得光滑、圆润。这些变化均随DSF-Cu浓度的增大而愈加明显，当药物浓度达到150和200 nmol·L-1 DSF-Cu时，细胞结构完全被破坏，不仅皱缩更明显，而且开始出现胞质外漏、边缘模糊，膜表面变得异常平整，光滑，伪足结构完全消失。见 Fig 5。
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| 图 5 Morphological changes of CNE-2Z cells after treated with different concentration of DSF-Cu for 24 h determined by atomic force microscope A1~E1：Peak force error images;A2~E2：Height images;A3~E3：Three-dimensional morphology images;A4~E4：Profile line analysis of height and width of cells corresponding to the white lines in A2~E2 |
AFM不仅可以得到高分辨的细胞表面形貌图，还可以实现对单细胞的定量分析。用AFM 自带软件分别对每组细胞高度测量发现：与对照组(1.85±0.23) μm相比，50、100、150、200 nmol·L-1 DSF-Cu实验组细胞高度依次增加至(2.31±0.38)、(3.18±0.26)、(3.64±0.31)和(4.08±0.42) μm(P＜0.01)。细胞宽度测量发现：与对照组(37.29±3.4) μm相比，50、100、150、200 nmol·L-1 DSF-Cu实验组细胞宽度依次减小至(27.17±1.12)、(23.74±0.63)、(18.86±1.17)和(14.64±1.25) μm(P＜0.01)。对每组细胞(2×2) μm2区域细胞膜表面粗糙度进行分析测量发现：细胞表面均方根粗糙度(root-mean-squared roughness，Rq)与对照组(88.18±22.57) nm相比，50、100和150 nmol·L-1 DSF-Cu实验组Rq依次降低至(73.17±12.76)、(64.06±9.96)和(53.70±15.07) nm(P＜0.01)。平均粗糙度(average roughness，Ra)与对照组(71.11±19.57) nm相比，50、100和150 nmol·L-1 DSF-Cu实验组Rq依次降低至(59.19±11.02)、(51.17±8.79)和(42.12±13.49) nm(P＜0.01)。值得注意的是，最高浓度200 nmol·L-1实验组的Rq和Ra分别为(97.19±35.12)和(74.74±26.46) nm，反而高于其他各组。分析以上数据说明，随着药物浓度增大，细胞形貌破坏加剧。见Fig 6。
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| 图 6 Histograms of statistical results of morphological changes of CNE-2Z cells after treated with different concentration of DSF-Cu for 24 h determined by atomic force microscope A:Height;B:Width;C:Root-mean-squared roughness(Rq);D:Average roughness(Ra).**P<0.01 vs control group |
利用Rhodamine-Phalloidin染色观察50、100、150和200 nmol·L-1 DSF-Cu作用于CNE-2Z细胞24 h后，对细胞微丝结构的表达和分布的影响。对照组CNE-2Z细胞胞质密集分布丰富的F-actin，且在胞体四周布满很多细丝状F-actin。 经过不同浓度的DSF-Cu处理后，F-actin发生重组，结构遭到明显的破坏，表现为F-actin 荧光强度逐渐减弱，丝状结构回缩直至完全消失，微丝分布紊乱，在最高浓度组形成“戒指”样形状，分布在细胞膜。见Fig 7。
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| 图 7 Expression and distribution of F-actin stained with Rhodamine-phalloidin(red) and the nuclei stained with Hoechst 33258(blue) after treated with different concentration of DSF-Cu for 24 h determined by laser scanning confocal microscope |
鼻咽癌在中国南方，尤其是广东省，其发病率较欧美等其他地区高25~30倍[9]。鼻咽癌临床上属上皮源性恶性肿瘤，恶性程度较高，有着高度的侵袭性及转移性，患者5年生存率仅60%左右[10]。临床治疗以放疗联合顺铂化疗为主，但在治疗过程中大剂量多药联合化疗的毒副反应导致患者不耐受等严重并发症，影响其疗效，且在一定程度上诱发了鼻咽癌的复发或转移。当前新型的分子靶向治疗药物存在开发成本高、价格昂贵等问题，而从价廉且毒副作用小的传统药物中开发高效、低毒的抗肿瘤药物成为研究的热点。
DSF是一种能够抑制醇脱氢酶的二硫代氨基甲酸盐药物，临床上广泛用于抗酗酒，价格低廉，安全性好，近年来其抗肿瘤活性越来越受到关注[4]。研究发现[6]，DSF-Cu复合物可选择性地杀伤多种恶性肿瘤，且同时赦免正常细胞。目前关于DSF-Cu的抗肿瘤的具体作用机制尚不完全明确，且其对鼻咽癌作用的相关报道也很少。本研究结果表明，DSF-Cu可诱导人低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡和G2/M期细胞阻滞，表明DSF-Cu可通过阻滞细胞周期的正常转变，有效抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤生长的作用。进一步检测凋亡相关信号发现DSF-Cu可促进CNE-2Z细胞内ROS水平的增加及诱导MMP的下降，提示DSF-Cu可能是通过影响ROS的水平，导致线粒体功能改变，氧化还原水平失衡，发生氧化应激反应，进而诱导细胞发生凋亡。ROS作为重要的凋亡诱导因子，在线粒体途径的凋亡过程中具有重要的调控作用，正常情况下，细胞内多种分子发生氧化还原反应，均可产生一定量的ROS，如超氧化物阴离子自由基、过氧化氢、氢过氧基和氢氧根等。一方面ROS 参与正常的各种代谢活动，另一方面既使ROS产生的多一些，也会被细胞内各种活性氧清除剂，例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等所清除，维持一定的动态平衡。而当各种因素导致的ROS过量生成时，在ROS 释放与蓄积过程中，ROS 会促使线粒体内膜上形成大量非特异性的通透转换孔,使膜间隙的正离子不断进入基质,导致内膜两侧离子梯度消失,使线粒体膜电位逐渐下降直至消失，从而使线粒体内膜上的细胞色素C等促凋亡因子释放入细胞质中，扰乱细胞内正常的氧化还原平衡，导致细胞内蛋白质、脂质和DAN的氧化损伤，从而引发细胞功能障碍，最终导致通过线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡和坏死[11]。因此ROS的产生堆积和MMP的降低都是细胞凋亡中的重要事件，且两者相互促进，在细胞凋亡中发挥重要作用。 已有文献报道，DSF-Cu的抗肿瘤作用与NF-κB通路、JNK通路及ROS有关[12]，DSF可直接与线粒体膜上游离的巯基结合形成二硫化物，影响线粒体膜电位及诱导ROS的产生，从而活化一系列氧化还原相关的信号通路，这与我们的实验结果一致。
AFM是一种新型的具有纳米级分辨率的表面成像工具，在分子生物学、细胞生物学以及生物医学等领域的应用正日益广泛。 能够在接近生理条件下对细胞进行表面超微结构和生物机械性能的测量，比如细胞的硬度、黏附力以及抗原-抗体亲和力等分析[13]。尤其在研究药物对肿瘤细胞的抗肿瘤机 制方面，AFM 显示出其独特的优势，成为细胞生物学研究的一种有效工具。细胞膜是防止细胞外物质自由进入细胞的屏障，对调节细胞功能和生理过程， 如物质运输、激素和药物的作用、 信号传导、 细胞表面识别、 细胞存活等起着关键作用[14-15]，因此细胞膜结构的变化直接影响着细胞的正常功能。本研究从纳米级水平上定性定量地分析了DSF-Cu作用CNE-2Z 细胞24 h 后细胞出现皱缩、 变圆，丝状伪足回缩以至结构遭到完全破坏；且胞质外漏、 边缘模糊、 膜表面的颗粒减少，变得异常光滑、平整，细胞膜表面粗糙度明显下降。以上结果与流式检测到的DSF-Cu具有诱导细胞凋亡的结果相吻合。细胞伪足与癌细胞的运动、迁移和侵袭能力密切相关，AFM观察到CNE-2Z细胞丝状伪足的变化，说明DSF-Cu可能通过抑制鼻咽癌细胞的侵袭能力而发挥其抗肿瘤活性。最后利用激光共聚焦显微镜观察到经DSF-Cu作用后的CNE-2Z细胞，胞内的骨架蛋白之一的F-actin发生重排，结构遭到严重破坏，再次证实DSF-Cu可抑制CNE-2Z细胞的迁移和侵袭 能力，具有潜在的抗肿瘤转移的作用。至于细胞骨架的这些变化仅仅是DSF-Cu对CNE-2Z细胞产生细胞毒性过程中的一种现象，还是F-actin的重组在DSF-Cu抗肿瘤效应中参与了信号传导及蛋白调节作用尚需进一步研究。
综上所述，本研究证实DSF-Cu可诱导鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡，其作用机制与线粒体凋亡通路有关。同时，原子力显微镜和激光扫描共聚焦显微镜相结合，在纳米级的水平上为揭示细胞的生理病理状态提供了微观形态学参考，同时为实现通过单细胞研究抗肿瘤药物的抗癌机制提供有用的数据支持。
( 致谢: 本实验流式细胞检测、激光扫描共聚焦显微镜的拍摄、原子力显微镜的测试部分主要在暨南大学分析测试中心完成，细胞培养和药物处理部分在暨南大学医学院药理学实验室完成。感谢杨亚萍、汪亚帷、李梦佳、张可凡和孙晓雪在细胞培养、检测各个实验项目、论文写作和数据处理所做的工作；感谢梁志红在原子力显微镜使用过程中的指导工作；感谢陈丽新、王立伟、杨海峰和朱林燕在实验设计、论文修改所做的工作。 )
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