2. 黑龙江省齐齐哈尔市 第一医院，黑龙江 齐齐哈尔 161005;
3. 广西医科大学附属肿瘤医院，广西 南宁 530021
2. Tsitsihar First Hospital of Heilongjiang Province，Tsitsihar Heilongjiang 161005，China ;
3. Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021，China
原发性肝癌是一种发病率高、发现晚、恶化程度高的消化系统恶性肿瘤，严重威胁人类的生命和健康。近年的流行病学调查显示，我国肝癌死亡率在各种恶性肿瘤中居于第三位[1]，而广西肝癌死亡率居恶性肿瘤之首位，且乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是诱导肝癌发生的重要病因[2]。因此，积极探究肝癌的发病机制、寻找有效抑制乙肝病毒感染的抗肝癌药物具有重要的现实意义。
蒽醌类化合物广泛存在于天然植物中，如大黄、何首乌、黄根等，随着对蒽醌类物质研究的深入，发现其具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等重要的药理作用。如今临床上广泛应用的阿霉素、米托蒽醌等化疗药物就属于蒽醌类化合物。大黄酸是一种研究较多的蒽醌化合物，可通过阻滞细胞周期、增强半胱天冬氨酸蛋白酶活性等机制诱导肝癌细胞凋亡[3-4]。但其诱导细胞凋亡是否通过抑制乙肝病毒的复制、分泌作用尚不清楚，且大黄酸水溶性较差，与临床抗肿瘤药物相比存在特异性不高、功效低等问题，影响其生物活性的发挥。
为了进一步开发大黄酸及蒽醌化合物的药用价值，减少乙型肝炎病毒诱发肝癌的可能，改善肝癌高发生率、高死亡率的现状，寻找更理想的抗肝癌药物，本文以大黄酸为原料合成了溶解度好、毒性小、抗肿瘤活性强且抑制病毒能力高的8-溴乙氧基大黄酸，并探讨该合成产物对人肝癌HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响及其作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 药物与试剂大黄酸购自南京郎泽生物医药有限公司，含量大于98%；拉米夫定(3TC)为葛兰素史克制药(苏州)有限公司生产；二甲基亚砜、丙酮、1，2-二溴乙烷、乙酸乙酯、石油醚(分析纯，汕头西陇化工)；噻唑蓝(MTT，北京Solarbio公司)；MEM培养基(Hyclone)；小牛血清(Gibco)；胰酶(美国 Amersco 公司)； Fluo-3/AM(美国Biotium公司)；HBsAg和HBeAg ELISA 检测试剂盒(上海科华生物工程有限公司)；周期检测试剂盒(Bender Med system)；鼠抗HBx(Santa Cruz)；兔抗GAPDH(Abcam)；羊抗鼠lgG-HRP(Santa Cruz)；Goat pAb to Rb lgG-HRP(Abcam)；超敏ECL化学发光即用型底物(Boster Biological Technology)。
1.1.2 仪器Set-laborata4000旋转蒸发仪(德国 Heidolph 公司)；Axiovert 200荧光倒置相差显微镜(德国 Zeiss 公司)；化学发光成像工作站(FlourChem M)；Calibur流式细胞仪(美国BD公司)；激光共聚焦显微镜 NikonA1(日本尼康出品)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；Multiskan MK3酶标仪(美国Thermo公司)；1H-NMR 和13C-NMR采用500兆核磁共振仪(美国 Vrain 公司)测定；红外光谱由100FTIR光谱仪(美国 Perkin Elmer 公司)测定。
1.1.3 细胞人肝癌HepG2.2.15细胞购自武汉大学保藏中心细胞库。细胞在37℃、5% CO2培养箱内以含10%小牛血清的MEM培养液在培养瓶内单层传代培养，取对数生长期细胞进行实验。
1.2 方法 1.2.1 8-溴乙氧基大黄酸的合成在100 mL三口瓶中依次加入500.0 mg大黄酸(1.76 mmol)，486.0 mg碳酸钾(3.52 mmol)，35 mL DMF，混匀加热到60℃，恒温搅拌30 min，缓慢滴加5.291 g(28.16 mmol)1,2-二溴乙烷，TLC点板检测跟踪反应进程，反应1.5 h后TLC点板，反应原料点消失。过滤除去碳酸钾。加入丙酮，使DMF与丙酮形成共沸物，80℃减压旋蒸除去大部分DMF，将浓缩的反应液倒入冰水中静止，析出沉淀，过滤，用冰水洗涤多次，将残留的DMF除去，得到粗品。采用硅胶柱层析，以石油醚 ∶乙酸乙酯(80 ∶1)为洗脱剂洗脱，除去溶剂，得到橙黄色固体，合成产物进行理化性质及结构鉴定。
1.2.2 合成产物配制合成产物用DMSO溶解后配成10 g·L-1原液，0.2 μm有机系滤膜过滤除菌，避光保存。药物使用时，采用无血清培养基配制成所需的浓度，并使DMSO 终浓度小于2%。
1.2.3 MTT法测定8-溴乙氧基大黄酸对细胞生长的抑制作用取对数生长期的HepG2.2.15细胞，以6.8×107·L-1密度接种于96孔板，每孔100 μL，培养24 h后，分别加入100 μL浓度为40、20、10、5、2.5、0 mg·L-1的8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸，每个浓度设3个复孔。连续培养72 h，每孔加入MTT 20 μL，继续培养4 h后小心吸弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL使结晶完全溶解。采用酶标仪在492 nm处检测吸光度值(OD值)。按下列公式计算细胞生长的抑制率和半数抑制浓度IC50值。生长抑制百率/%=[1-(药物组OD值/对照组OD值)]×100%，选择对细胞数量及形态几乎无影响的相应剂量作为后续研究的浓度。
1.2.4 ELISA法定量检测细胞HBsAg和HBeAg分泌情况将2.5×107·L-1的细胞悬液加入24孔细胞培养板，每孔1 mL，置 CO2孵箱中培养24 h后除去全部培养液。分别加入对细胞数量及形态几乎无影响的IC15、IC10、IC5 3个终浓度的不同药物溶液，每个浓度设3个复孔。空白对照组加入等量的完全培养液，参照文献选择100 mg·L-1拉米夫定为阳性对照[5]。连续培养72 h后，分别吸出细胞上清液置于1.5 mL灭菌离心管中，-20℃保存，统一待检。采用ELISA试剂盒对上清HBsAg、HBeAg进行检测，操作按试剂盒的使用说明书进行，结果以抑制率表示。药物对抗原的抑制百分率(IR)/%=[1-(药物组OD值/对照组OD 值)]×100%。
1.2.5 流式细胞仪测定细胞周期将HepG2.2.15细胞接种于6孔板中24 h后，加入药物浓度均为IC10的8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸，以等量的完全培养液为空白对照，以拉米夫定为阳性对照药。处理72 h后，胰酶消化后用PBS漂洗，调整细胞浓度为6×108·L-1。75%乙醇固定过夜，加入RNase A、300 μL碘化丙啶(PI)，4℃避光下作用30 min。用流式细胞仪分析细胞周期的分布。
1.2.6 Western blot法检测细胞内HBx蛋白8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸均以IC10的药物浓度处理HepG2.2.15细胞，以等量的完全培养液为空白对照,含100 mg·L-1拉米夫定的等量完全培养液为阳性对照。细胞经药物处理72 h后，提取蛋白,用 BCA 法检测蛋白含量后,以相同的蛋白量上样,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,转PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭,鼠抗HBx(按1 ∶100稀释)一抗稀释液4℃孵育过夜，PBST洗涤3次，再用HRP标记的山羊抗鼠 IgG(按1 ∶1 000稀释)二抗稀释液常温孵育2 h，PBST 洗涤3次，超敏ECL化学发光即用型底物反应后，用化学发光成像仪扫描结果。
1.2.7 激光共聚焦检测细胞内游离钙离子浓度取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×108·L-1，接种于激光共聚焦显微镜专用培养皿中，每皿2 mL细胞悬液。培养24 h后，弃去原培养液，加入药物浓度为IC10的8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸，以等量的完全培养液为空白对照，以拉米夫定为阳性对照药。处理72 h后用 HEPES缓冲液洗3遍，每皿加入8 μmol·L-1的 Fluo-3/AM荧光染料，37℃避光负载50 min，HEPES缓冲液洗3遍，于激光扫描共聚焦显微镜下，选择激发波长488 nm，发射波长530 nm，激光强度9.0，光电倍增管电压110 v条件下摄图。记录并分析荧光强度。
1.2.8 统计学分析计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验。SPSS 16.00进行统计分析。
2 结果 2.1 8-溴乙氧基大黄酸的结构鉴定合成产物为橙黄色粉末，mp：156℃~158℃，纯度为98.0%。IR、1H-NMR和13C-NMR数据见Tab 1。
| Compound | IR(σ/cm-1) | 1H-NMR(δ) | 13C-NMR(δ) |
| 8-bromo-ethoxy Rhein | 1569 | 3.678(2H,t,CH2Br) | 28.3(-CH2Br),65.24(-OCH2),115.95(C-9a), |
| 1479,1449 | 4.695(2H,t,-OCH2) | 118.60(C-8a),120.44(C-4),120.59(C-5), | |
| (Ar,=CH) | 7.342~7.327(1H,dd,7-ArH) | 125.10(C-2),125.62(C-7),133.56(C-4a), | |
| 3435(OH) | 7.731(1H,t,6-ArH) | 134.11(C-10a),137.38(C-6),137.97(C-3), | |
| 1730(carboxyl | 7.877~7.863(1H,dd,5-ArH) | 162.52(C-8),162.97(C-1), | |
| C=O) | 7.954(1H,d,2-ArH) | 164.06(-COOH),180.99(C-10), | |
| 1674，1633 | 8.423(1H,d,4-ArH) | 192.91(C-9) | |
| (C=O) | 11.942(1H,s,-OH) | ||
| 12.027(1H,s,-COOH) | |||
从Tab 2可知,随着8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸浓度的增高,HepG2.2.15细胞抑制率相应增高，呈浓度依赖性。8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸对HepG2.2.15作用72 h的IC50分别为14.29 mg·L-1和11.59 mg·L-1。结合细胞形态学观察，当8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸的抑制率小于15%时，HepG2.2.15细胞无论在形态上还是数量上与空白对照相同。因此,选择8-溴乙氧基大黄酸IC15(6.76 mg·L-1)、IC10(5.02 mg·L-1)、IC5(3.16 mg·L-1)和大黄酸IC15(6.03 mg·L-1)、IC10(4.89 mg·L-1)、IC5(2.88 mg·L-1)作为后续研究浓度。
| Drug concentration /mg·L-1 | Inhibitory rate/% | |
| 8-bromo-ethoxy Rhein | Rhein | |
| 40 | 98.83±0.25 | 95.81±1.61 |
| 20 | 54.47±2.15 | 80.87±2.09 |
| 10 | 26.30±2.22 | 31.55±2.90 |
| 5 | 8.67±1.77 | 12.19±2.91 |
| 2.5 | 2.15±1.41 | 2.24±0.68 |
| IC50/mg·L-1 | 14.29±0.67 | 11.59±1.34 |
经无细胞毒浓度IC15、IC10、IC5作用72 h后，8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg 有明显的抑制作用，除了IC5浓度外，其他各组浓度对病毒抑制作用与阳性药物拉米夫定相似。且抑制作用随着浓度的增加，几乎呈现剂量依赖性。同时在相同抑制率浓度下，8-溴乙氧基大黄酸对病毒HBsAg的抑制效果优于大黄酸(Tab 3)。
| Drug and dose | HBsAg inhibitory rate/% | HBeAg inhibitory rate/% | ||||
| IC15 | IC10 | IC5 | IC15 | IC10 | IC5 | |
| 8-bromo-ethoxy Rhein | 43.70±1.29* | 44.09±0.69* | 30.71±1.28** | 29.45±2.82 | 24.96±2.36 | 21.93±1.16* |
| Rhein | 32.68±3.48 | 25.59±1.58 | 12.20±0.91 | 30.03±2.12 | 34.74±4.88 | 13.17±1.55 |
| 3TC/100 mg·L-1 | 27.17±3.01 | 14.86±0.79 | ||||
| *P<0.05,**P<0.01 under the concentration at the same inhibitory rate,8-bromo-ethoxy Rhein was compared with Rhein | ||||||
与空白对照组相比，经药物浓度为IC10的8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸作用72 h后，细胞G1、G2和S期分布差异均无显著性(P>0.05) ；而阳性对照组拉米夫定与空白对照组相比，G1、G2和S期差异均存在显著性(P<0.01)。见Fig 1。
|
| Fig 1 Effect of 8-bromo-ethoxy Rhein on cell cycles in HepG2.2.15 cells **P<0.01 vs control |
如Fig 2所示，人肝癌细胞HepG2.2.15细胞中HBx蛋白表达较高，与空白对照组比较，拉米夫定和8-溴乙氧基大黄酸均能够明显降低HBx蛋白的表达(P<0.05)，而未经结构修饰的大黄酸并不能降低HBx蛋白的表达。提示大黄酸经结构修饰后的8-溴乙氧基大黄酸具有更强的抑制肝癌病毒作用。
|
| Fig 2 Effect of 8-bromo-ethoxy Rhein on HBx in HepG2.2.15 cells(x±s，n=3) *P<0.05，**P<0.01 vs control |
细胞内钙离子与Fluo-3/Am荧光染料结合后显绿色荧光,其荧光强度与细胞内钙离子的浓度成正相关。研究发现，HBx可激活钙离子刺激的转录因子，其在宿主细胞中调节HBV DNA复制与释放线粒体内钙引起的胞质钙离子浓度升高密切相关。
从Tab 4结果可见，在正常情况下，HepG2.2.15细胞内有钙离子存在，经药物浓度为IC10的8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸处理24 h后，大黄酸对钙离子浓度影响不大；而8-溴乙氧基大黄酸使钙离子浓度下降，与空白组比较，差异存在显著性(P<0.05)。结果证明，8-溴乙氧基大黄酸与阳性对照拉米夫定作用相似，可降低HepG2.2.15细胞内钙离子浓度。
3 讨论乙型肝炎病毒感染是我国肝癌发生的最主要原因，抗HBV在治疗肝癌中具有举足轻重的作用。目前，公认的抗HBV治疗药物主要有α干扰素和核苷类似物[6]。大多数核苷类药物可抑制HBV DNA聚合酶活性进而抑制病毒,从而达到抗HBV疗效；而α干扰素通过抑制HBV的复制和免疫调节机制,调节机体对HBV的免疫应答,二者协同抗病毒[7-8]。但干扰素不良反应较大，核苷类似物存在病毒耐药问题，大多数患者在长期治疗后仍不能彻底清除病毒。因此，开发筛选新型低毒的抑制乙肝病毒复制抗肝癌药物，并探明其作用机制是目前研究的热点和难点。
大黄酸等蒽醌类化合物具有抗病毒、保肝抗纤维化、抗肝癌等药理活性，且药理作用已被医学界广泛认可。蒽醌类化合物呈平面型的多芳香环结构[9],这种结构可以嵌入到DNA 相邻的碱基对之间,以嵌入的形式与 DNA双螺旋形成可逆的结合,使DNA降解,并抑制 DNA拓扑异构酶II,使DNA与拓扑异构酶II形成的复合物僵化,影响DNA的转录、合成，从而达到抗肿瘤的作用[10-13]。但是蒽醌环结构对DNA的嵌入作用是可逆的，通过侧链结构的修饰可以提高蒽醌类药物对DNA的嵌入作用,提高蒽醌类药物与肝癌细胞的亲合力。为了增加蒽醌环对肝癌细胞的亲合力，得到溶解性好、毒性小、抗肿瘤活性强且抑制病毒能力高的抗肝癌药物，本研究在大黄酸的基础上对侧链进行修饰，合成了8-溴乙氧基大黄酸。结果表明，8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸均可抑制人肝癌细胞HepG2.2.15的HBsAg 、HBeAg病毒的分泌，且8-溴乙氧基大黄酸的抑制病毒作用优于大黄酸。推测改变大黄酸的侧链结构可以抑制蒽醌环结构对DNA的嵌入作用的可逆性，促进病毒DNA的降解。
HBV基因组含有 S 、C 、P 、X 4个开放读码框，其中X基因编码HBx蛋白。HBx具有广泛的反式激活功能，激活同源或异源基因的启动子，促进病毒复制和正常肝细胞感染，对肝癌的发生、发展至关重要。实验研究发现，将HBx导入小鼠的肝细胞中，可引起肝细胞的恶性转化。将HBx基因转入小鼠体内，可诱发转基因小鼠肝癌形成，缺失X基因的乙型肝炎病毒不能有效地进行感染[14, 15]。HBx表达越高，其感染能力就越强，通过抑制或减少HBx表达则可降低HBV感染能力，有利于肝癌的治疗。此外，HBx涉及钙信号途径的介导，能够上调细胞内钙离子浓度来保持HBV复制能力[16]。如Bouchard等[17]指出，HBx蛋白对病毒复制的影响与细胞内钙信号传导通路有关，通过影响细胞内钙离子浓度，激活Pyk2，进而通过Src影响HBV病毒的复制。故推测，减少细胞内钙离子浓度可间接减少HBx的促HBV激活能力，同时可减少肝癌细胞转化的机会。
| Drug | Fluorescence intensity |
| Control | 431.83±1.17 |
| 3TC | 340.90±0.10** |
| 8-bromo-ethoxy Rhein | 418.32±1.19* |
| Rhein | 443.39±4.40 |
| *P<0.05，**P<0.01 vs control | |
HepG2.2.15细胞系是肝癌细胞HepG2稳定转染4个全长HBV基因组而建立的,能够稳定分泌HBsAg、HBeAg及Dane颗粒,可检测到细胞内各种中间复制体,为研究HBV复制和调控的分子机制提供了一个有效的体外实验模型[18-19]。本研究利用HepG2.2.15细胞模型证实,8-溴乙氧基大黄酸可明显降低线粒体钙离子通道中钙离子浓度(P<0.01)，与Western blot法结果中HBx蛋白的表达降低(P<0.05)相辅相成,共同说明8-溴乙氧基大黄酸可调节HepG2.2.15细胞内HBV DNA,降低HBx蛋白的表达,从而减弱HBV病毒的感染能力,最终提高抑制HBV病毒的抗肿瘤作用。此外，研究中还发现，经无细胞毒剂量8-溴乙氧基大黄酸、大黄酸作用HepG2.2.15细胞后，细胞周期各时相的分布与空白对照组比较无差异，其抑制HepG2.2.15细胞分泌病毒的作用机制与拉米夫定存在部分差异，8-溴乙氧基大黄酸有效发挥作用的分子机制仍有待进一步研究。
综上所述,8-溴乙氧基大黄酸具有调控细胞HBx蛋白的表达，影响细胞线粒体膜内钙离子浓度变化,抑制细胞HBV病毒的复制、肝癌细胞的生长和分泌乙肝病毒的能力等活性，说明对具有蒽醌母环结构的化合物进行结构修饰，有可能获得有应用前景的新型低毒抗肝癌药物，为肝癌的临床辅助治疗研究提供了重要依据。
( 致谢: 本文实验在广西医科大学医学科学实验中心完成，特此致谢。 )
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