2. 广州市番禺区心血管疾病研究所，广东 广州 511400;
3. 中山大学附属第一医院黄埔院区心血管内科CCU，广东 广州 510700;
4. 中山大学附属第一医院心血管内科，广东 广州 510080
2. Cardiovascular Institute of Panyu District, Guangzhou 511400, China ;
3. Cardiac Care Unit of Dept of Cardiology, Huangpu Division of the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510700, China ;
4. Dept of Cardiology, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China
细胞死亡是生命的基本过程，不仅参与生物的发育和自稳平衡，在多种疾病的发生、发展过程中也发挥重要的作用。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病的重要并发症之一，严重地危害着人类的健康与生命。在DCM发生过程中，心肌细胞死亡起关键性的启动作用。Cai等[1]报道：在糖尿病患者和动物模型中都可观察到心肌细胞死亡。细胞死亡可分为凋亡(apoptosis)、坏死(necrosis)、自噬(autophagy)和坏死性凋亡(necroptosis，Nec)[1-5]。Nec是Degterev等于2005年首次报道的一种细胞死亡方式，广泛参与缺血性心脑血管疾病、肝肾脏器损害、肿瘤及炎症反应等病理生理过程[3, 6-8]。在启动Nec过程中，受体相互作用蛋白(receptor interaction protein，RIP)发挥重要的作用。目前，RIP蛋白家族由RIP1～RIP7共7个成员组成，其中RIP1 和RIP3 是参与Nec的重要分子蛋白，两者的活化并形成复合物是启动Nec的关键。多项实验证实，RIP3是调控Nec的特异性蛋白因子，过量表达的RIP3可导致Nec发生，沉默或下调RIP3的表达可不同程度地阻止细胞发生Nec[7, 9-10]。有研究报道，在链脲霉素(streptozotocin)诱导的糖尿病大鼠，心肌纤维化、肥厚、炎症的发生伴随着RIP3的大量表达[11]，提示Nec可能参与高血糖引起的心肌损伤。另有报道指出：Nec与p38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路的关系非常密切，p38MAPK通路可介导Nec的发生[12-13]。但是，在DCM细胞模型中，Nec能否介导高糖(high glucose,HG)引起的心肌细胞损伤，Nec与p38MAPK之间的关系如何，目前尚未见报道。
为此，本研究通过HG损伤H9c2心肌细胞建立DCM细胞模型[14]，旨在探讨：① Nec能否介导HG引起的心肌细胞损伤；② 在HG损伤心肌细胞过程中，Nec和p38MAPK通路之间是否存在相互作用关系。
1 材料与方法 1.1 材料抗RIP3抗体、抗p-p38MAPK抗体和抗t-p38MAPK抗体购自Cell Signaling(USA)；特级胎牛血清购自Gibco BRL(USA)；DMEM培养基由Hyclone公司(USA)供应；罗丹明123(rhodamine 123,Rh 123)和双氯荧光素( 2’，7’-dichlorfluorescein-diacetate，DCFH-DA)、SB203580(p38MAPK通路抑制剂)、necrostatin-1(Nec-1，Nec特异性抑制剂)购自Sigma-Aldrich(USA)；SB203580和Nec-1按照产品说明采用二甲基亚砜(DMSO)溶解后、DMEM培养基稀释至目标浓度使用；细胞计数试剂盒8(cell counter kit-8,CCK-8)由Dojindo Lab(Japan)提供；H9c2 心肌细胞取自中山大学实验动物中心。
1.2 细胞培养及实验分组H9c2 心肌细胞来源于大鼠胚胎期的心脏组织，置于含5% CO2的37 ℃温箱中，于含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。实验分为6组：(A)对照(control)组：DMEM培养基(5.5 mmol·L-1 葡萄糖)处理心肌细胞24 h；(B)高糖(high glucose,HG)组：35 mmol·L-1葡萄糖作用心肌细胞24 h；(C)Nec-1+HG组：100 μmol·L-1 Nec-1和35 mmol·L-1葡萄糖共处理心肌细胞24 h；(D)SB203580+HG组：3 μmol·L-1 SB203580作用心肌细胞60 min，撤去，PBS洗2次，然后35 mmol·L-1葡萄糖处理心肌细胞24 h；(E)Nec-1组：100 μmol·L-1 Nec-1和DMEM培养基共处理心肌细胞24 h；(F) SB203580组：3 μmol·L-1 SB203580作用心肌细胞60 min，撤去，PBS洗2次，然后DMEM处理心肌细胞24 h。
1.3 CCK-8 测定心肌细胞存活率将H9c2 心肌细胞接种于96孔培养板中，当细胞生长至约80%培养孔面积时，按照分组采取不同的处理后，弃上清，PBS液洗3次，于每孔加入90 μL DMEM和10 μL CCK-8溶液，37 ℃温箱中孵育2.5 h，酶标仪(λ=450 nm)记录各孔的吸光度(A)。取5孔A值的平均数，按以下的公式计算细胞存活率：细胞存活率/%=处理组A /对照组A×100%。实验重复5次。
1.4 DCFH-DA染色测定细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平将H9c2 心肌细胞接种于24孔培养板中，当细胞生长至约80%培养孔面积时，按照分组采取不同处理后，PBS液洗3次，加入10 μmol·L-1 DCFH-DA染液，37℃温箱中孵育30 min，然后用PBS液洗3次。在荧光显微镜下随机选取5个不重复区摄片，用ImageJ 1.47i软件分析5个视野绿色荧光强度的平均值[平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)，能间接反映ROS水平，数值越大，表示ROS水平越高]，并进行数据统计分析。实验重复5次。
1.5 Rh 123染色测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)将H9c2 心肌细胞接种于24孔培养板中，当细胞生长至约80%培养孔面积时，按照分组采取不同处理后，PBS液洗3次，加入10 μg·L-1 Rh 123染液，37 ℃温箱中孵育45 min，然后PBS液洗3次。在荧光显微镜下随机选取5个不重复区摄片，细胞核周围绿色的亮点即为摄取了Rh 123的线粒体。Image J 1.47i软件分析5个视野绿色荧光的MFI(其数值大小可反映MMP水平高低)，并进行数据统计分析。实验重复5次。
1.6 蛋白质免疫印迹法检测RIP3和p38MAPK蛋白的表达水平将H9c2 心肌细胞接种于60 mm培养皿中，培养至约80%满时，按照实验分组采取不同的处理后，去上清液，PBS液洗涤后加入细胞裂解液，4 ℃摇床中作用30 min，14 000×g高速离心10 min，吸取上清液，二喹啉甲酸法进行蛋白定量。总蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到二氟化树脂膜上。5%脱脂奶粉常温下封闭60 min，随后分别加入抗RIP3、抗t-p38或抗p-p38 抗体(浓度为1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜，用预冷的TBST洗3 次，每次5 min，然后与相应的二抗(浓度为1 ∶2 500)室温下孵育1.5 h，再予TBST洗3次，每次5 min。用增强化学发光法使二氟化树脂膜显色，暗室中将显色条带曝光到医用X线片上，凝胶成像系统扫描分析结果。实验重复5次。
1.7 统计学处理全部数据均采用 SPSS 17.0软件进行统计分析，结果以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，用SNK-q进行均数之间的两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 Nec-1和SB203580抑制高糖引起的心肌细胞毒性Fig 1A显示，35 mmol·L-1 葡萄糖(高糖，HG)作用心肌细胞24 h可引起明显的心肌细胞毒性，降低细胞存活率，与正常对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。分别应用75、100、200、400、600、800 μmol·L-1 Nec-1与HG共处理心肌细胞24 h，均能使细胞存活率升高，与HG组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中100 μmol·L-1 Nec-1对细胞毒性的抑制作用最为明显。单纯采用75、100、200、400、600、800 μmol·L-1 Nec-1和DMEM分别共处理心肌细胞24 h均不影响细胞存活率(Fig 1B)。根据上述结果，本研究采用Nec-1的作用浓度为100 μmol·L-1。
|
| Fig 1 Nec-1 and SB203580 inhibit HG-induced cytotoxicity in H9c2 cardiac cells (n=5) 1: Control; 2: Glucose 35 mmol·L-1; 3: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; 4: SB203580 3 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; 5: Nec-1 100 μmol·L-1. 6: SB203580 3 μmol·L-1. **P<0.01 vs control group; #P<0.05,##P<0.01 vs the HG-treated group. |
与Nec-1的作用相类似，在HG作用前，应用3 μmol·L-1 SB203580预处理心肌细胞60 min，也可提高细胞存活率，与HG组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。3 μmol·L-1 SB203580本身对心肌细胞存活率无明显的影响(Fig 1C)。
2.2 Nec-1和SB203580抑制高糖引起的心肌细胞ROS堆积Fig 2B显示，采用HG作用H9c2 心肌细胞24 h可使胞内DCFH-DA的MFI升高至(31.4±1.37)%，与正常对照组[MFI值为(11.1±0.81)%，Fig 2A]相比，差异具有统计学意义(P<0.01)。然而，100 μmol·L-1 Nec-1和HG共处理心肌细胞24 h，可使MFI降低至(15.7±1.07)%，与HG组比较，两者差异具有统计学意义(P<0.01，Fig 2C)。单纯100 μmol·L-1 Nec-1和DMEM共处理心肌细胞24 h对心肌细胞ROS的生成无明显的影响(P>0.05，Fig 2E)。
|
| Fig 2 Nec-1 and SB203580 inhibit HG-induced accumulation of intracellular reactive oxygen species (ROS) in H9c2 cardiac cells (n=5) A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; D: SB203580 3 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; E: Nec-1 100 μmol·L-1. F: SB203580 3 μmol·L-1. **P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs the HG-treated group. |
与Nec-1的作用相类似，在HG作用前，应用3 μmol·L-1 SB203580预处理心肌细胞60 min，可使MFI降低至(14.2±0.78)%，与HG组比较，差异具有统计学意义(P<0.01，Fig 2D)。3 μmol·L-1 SB203580对心肌细胞ROS的生成无明显的影响(P>0.05，Fig 2F)。
2.3 Nec-1和SB203580抑制高糖引起的心肌细胞MMP丢失Fig 3显示，采用HG作用H9c2 心肌细胞24 h可使胞内Rh 123的MFI从(31.5±1.20)%(正常对照组，Fig 3A)降低至(10.6±0.90)%(Fig 3B)，两组差异具有统计学意义(P<0.01)。采用100 μmol·L-1 Nec-1和HG共处理心肌细胞24 h，可使MFI升高至(21.8±1.14)%(Fig 3C)，与HG组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。单纯Nec-1本身对心肌细胞MMP无明显的影响(P>0.05，Fig 3E)。
|
| Fig 3 Nec-1 and SB203580 inhibit HG-induced mitochondrial membrane potential (MMP) loss in H9c2 cardiac cells (n=5) A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; D: SB203580 3 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; E: Nec-1 100 μmol·L-1. F: SB203580 3 μmol·L-1. **P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs the HG-treated group. |
与Nec-1的作用相类似，在HG作用前，应用3 μmol·L-1 SB203580预处理心肌细胞60 min，可使心肌细胞内Rh 123的MFI升高至(20.5±1.20)%，与HG组比较，两者差异具有统计学意义(P<0.01，Fig 3D)。SB203580本身对心肌细胞MMP无明显的影响(P>0.05，Fig 3F)。
2.4 HG促进心肌细胞RIP3蛋白的表达Fig 4显示，HG分别作用H9c2心肌细胞1、3、6、9、12、24、36和48 h均能增加RIP3蛋白的表达，与正常对照组比较，差异均具有统计学意义(P均 ＜0.01)，其中HG作用心肌24 h时，RIP3表达增加最明显。
|
| Fig 4 HG promotes expression of RIP3 protein in H9c2 cardiac cells (n=5) H9c2 cardiac cells were exposed to HG for a 48 h period. **P<0.01 vs control group. |
如前所述，HG可上调心肌细胞RIP3蛋白的表达；在HG作用前，应用100 μmol·L-1 Nec-1和HG共处理心肌细胞24 h或应用3 μmol·L-1 SB203580预处理60 min后，再予HG作用心肌细胞24 h，RIP3的表达水平明显减少，与HG组对比，差异均具有统计学意义(P均<0.01)。100 μmol·L-1 Nec-1或3 μmol·L-1 SB203580本身对心肌细胞RIP3蛋白的基础表达无明显的影响(Fig 5)。
|
| Fig 5 Nec-1 and SB203580 attenuate HG-induced up-regulation of RIP3 expression in H9c2 cardiac cells (n=5) A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; D: SB203580 3 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; E: Nec-1 100 μmol·L-1. F: SB203580 3 μmol·L-1. **P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs the HG-treated group. |
Fig 6显示，应用HG处理心肌细胞24 h可使p-p38MAPK表达水平明显增加，与正常对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。应用100 μmol·L-1 Nec-1和HG共处理心肌细胞24 h，p-p38MAPK的表达水平明显降低，与HG组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。100 μmol·L-1 Nec-1本身对心肌细胞p-p38MAPK的基础表达无明显的影响。
|
| Fig 6 Nec-1 attenuates HG-induced up-regulation of p-p38MAPK expression in H9c2 cardiac cells (n=5) A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; E: Nec-1 100 μmol·L-1. **P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs the HG-treated group. |
心肌细胞死亡在DCM的发生过程中发挥重要作用[1]。细胞的死亡方式包括apoptosis、necrosis、autophagy和Nec[1-5]。已有实验证实：apoptosis、necrosis和autophagy参与DCM的发生和发展[2, 3, 15]。然而，Nec是否参与高血糖引起的心肌细胞损伤，目前尚未完全明了。最近，Liu等[11]观察到，糖尿病大鼠在出现左心室重构及舒张功能障碍的同时，伴随有RIP3表达明显增加，提示Nec与糖尿病大鼠心肌损伤有关。但是，他们没有应用抑制Nec的技术与方法进一步探讨Nec在糖尿病心肌损伤中的作用。本实验在观察到HG引起心肌细胞损伤(包括细胞毒性、氧化应激和线粒体损伤)的同时，能明显地上调心肌细胞RIP3蛋白的表达，采用Nec的特异性抑制剂Nec-1共处理心肌细胞不仅能减轻HG引起的心肌细胞损伤，使细胞存活率升高，ROS生成及MMP丢失减少，而且能明显地抑制RIP3表达的上调。上述结果清晰地提示：Nec介导HG引起的心肌细胞毒性、氧化应激和线粒体受损等损伤，这从细胞学水平进一步深化了Liu等[11]的研究结果，为阐明Nec在糖尿病心肌损伤中的作用提供了新颖的实验依据。
重要的是，我们进一步探讨了Nec与p38MAPK通路的关系。p38MAPK通路是MAPK家族的重要成员之一，可被各种刺激(如炎症、缺血缺氧、化学损伤等)激活，参与调控细胞生长、分化、凋亡等病理生理过程[16-17]。本研究和我们之前的研究[14, 18]表明，Nec和p38MAPK通路可介导HG引起的H9c2 心肌细胞损伤，然而它们两者之间的关系尚不清楚。在本实验中，Nec的抑制剂Nec-1能明显地抑制HG对p-p38MAPK表达的上调，提示Nec可通过激活p38MAPK通路引起心肌细胞损伤，这与之前其他细胞模型的研究结论相似[12-13]；另一方面，p38MAPK通路的抑制剂SB203580能对抗HG引起RIP3表达的上调，提示HG激活的p38MAPK通路可促进Nec的发生。因此，我们的研究证实：在HG损伤心肌细胞模型中，HG可激活p38 MAPK通路和诱导Nec发生，两者之间存在正相互作用，Nec可激活p38MAPK通路，而激活的p38MAPK通路也可促进Nec的发生，两者之间形成一个正反馈回路，在HG引起的心肌细胞毒性、氧化应激和线粒体损伤过程中发挥重要作用。
综上所述，本实验证实，Nec可介导HG诱导的H9c2 心肌细胞损伤，Nec与p38MAPK通路之间的正相互作用可能是HG引起心肌细胞损伤的重要机制之一。
( 致谢: 本实验在中山大学中山医学院科技楼开展，感谢冯鉴强教授和廖新学教授对本实验设计、文稿书写提出了很多宝贵的意见和建议。 )
| [1] | Cai L, Kang Y J. Cell death and diabetic cardiomyopathy[J]. Cardiovasc Toxicol, 2003, 3 (3) : 219-28 doi:10.1385/CT:3:3. |
| [2] | Nunes T, Bernardazzi C, de Souza H S. Cell death and inflammatory bowel diseases: apoptosis, necrosis, and autophagy in the intestinal epithelium[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014 : 218493 . |
| [3] | Zhou W, Yuan J. Necroptosis in health and diseases[J]. Semin Cell Dev Biol, 2014, 35 : 14-23 doi:10.1016/j.semcdb.2014.07.013. |
| [4] | 李欣志, 刘建勋. 缺血/再灌注过程中心肌细胞自噬研究进展[J]. 中国药理学通报, 2008, 24 (6) : 704-7 . Li X Z, Liu J X. Role of autophagy in cardiac myocyte during ischemia/reperfusion[J]. Chin Pharmacol Bull, 2008, 24 (6) : 704-7 . |
| [5] | 吴振, 吴立军, 田代真一, 等. 紫草素诱导HeLa细胞凋亡经过caspase激活的机制[J]. 中国药理学通报, 2004, 20 (5) : 540-4 . Wu Z, Wu L J, Tian D Z Y, et al. Shikonin induce HeLa cell apoptosis via a caspase-dependent mechanism[J]. Chin Pharmacol Bull, 2004, 20 (5) : 540-4 . |
| [6] | Zhao H, Jaffer T, Eguchi S, et al. Role of necroptosis in the pathogenesis of solid organ injury[J]. Cell Death Dis, 2015, 6 : e1975 doi:10.1038/cddis.2015.316. |
| [7] | Luedde M, Lutz M, Carter N, et al. RIP3, a kinase promoting necroptotic cell death, mediates adverse remodelling after myocardial infarction[J]. Cardiovasc Res, 2014, 103 (2) : 206-16 doi:10.1093/cvr/cvu146. |
| [8] | Degterev A, Huang Z, Boyce M, et al. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury[J]. Nat Chem Biol, 2005, 1 (2) : 112-9 doi:10.1038/nchembio711. |
| [9] | Cho Y S, Challa S, Moquin D, et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation[J]. Cell, 2009, 137 (6) : 1112-3 doi:10.1016/j.cell.2009.05.037. |
| [10] | Degterev A, Zhou W, Maki J L, et al. Assays for necroptosis and activity of RIP kinases[J]. Methods Enzymol, 2014, 545 : 1-33 doi:10.1016/B978-0-12-801430-1.00001-9. |
| [11] | Liu Y S, Huang Z W, Wang L, et al. Sitagliptin alleviated myocardial remodeling of the left ventricle and improved cardiac diastolic dysfunction in diabetic rats[J]. J Pharmacol Sci, 2015, 127 (3) : 260-74 doi:10.1016/j.jphs.2014.12.007. |
| [12] | Wang D, Zhao M, Chen G, et al. The histone deacetylase inhibitor vorinostat prevents TNFα-induced necroptosis by regulating multiple signaling pathways[J]. Apoptosis, 2013, 18 (11) : 1348-62 doi:10.1007/s10495-013-0866-y. |
| [13] | 贾晓芳, 张勤丽, 牛侨. MAPK信号通路在铝致SH-SY5Y细胞死亡中的作用[J]. 卫生研究, 2014, 43 (6) : 917-22 . Jia X F, Zhang Q L, Niu Q. MAPK signaling pathways involved in aluminum-induced apoptosis and necroptosis in SH-SY5Y cells[J]. J Hyg Res, 2014, 43 (6) : 917-22 . |
| [14] | Xu W, Wu W, Chen J, et al. Exogenous hydrogen sulfide protects H9c2 cardiac cells against high glucose-induced injury by inhibiting the activities of the p38 MAPK and ERK1/2 pathways[J]. Int J Mol Med, 2013, 32 (4) : 917-25 . |
| [15] | Varga Z V, Giricz Z, Liaudet L, et al. Interplay of oxidative, nitrosative/nitrative stress, inflammation, cell death and autophagy in diabetic cardiomyopathy[J]. Biochim Biophys Acta, 2015, 1852 (2) : 232-42 doi:10.1016/j.bbadis.2014.06.030. |
| [16] | Liu D, Yin D, Liao Z P, et al. Role of p38MAPK/14-3-3γ signal pathway in LPS preconditioning against cardiomyocytes anoxia/ reoxygenation injury[J]. Chin Pharmacol Bull, 2012, 28 (9) : 1239-43 . |
| [17] | 王超, 张会欣, 邢邯英, 等. 通心络胶囊抑制p38 MAPK磷酸化抑制糖尿病周围神经病变小鼠氧化应激[J]. 中国药理学通报, 2015, 31 (5) : 726-30 . Wang C, Zhang H X, Xing H Y, et al. Tongxinluo capsule inhibits oxidative stress in diabetic peripheral neuropathy mice by inhibiting the activity of p-p38 MAPK[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31 (5) : 726-30 . |
| [18] | 徐文明, 陈景福, 田丽红, 等. 瘦素-p38MAPK通路介导高糖对H9c2心肌细胞的损伤[J]. 中国动脉硬化杂志, 2014, 22 (5) : 433-7 . Xu W M, Chen J F, Tian L H, et al. Leptin-p38MAPK pathway mediates high glucose-induced injury in H9c2 cardiac cells[J]. Chin J Arterioscler, 2014, 22 (5) : 433-7 . |