2. 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210023
2. Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica,Nanjing 210023,China
糖尿病(diabetes mellitus,DM)以高血糖为主要特征，成为继肿瘤、心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性内分泌代谢性疾病[1-2]。研究发现[3-4]，在糖尿病发生及糖尿病血管病变过程中，晚期糖基化终末产物(AGEs)起到了关键性的作用。血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)是血管的屏障保护层，另外可产生和释放各种活性物质，维持血管正常功能和血液的供应状态。糖尿病血管病变发生最基本的是血管内皮细胞结构和功能的受损，持续的高血糖导致内皮细胞损伤及功能紊乱，增高血管内皮通透性，还可抑制内皮细胞的迁移、增殖[5-6]。
山茱萸环烯醚萜苷类成分能够明显改善糖尿病所致的内皮细胞损伤[7],同时其特征成分马钱苷、莫诺苷能明显抑制糖尿病大鼠肾皮质内皮细胞增生，减轻内皮细胞的肿胀程度，降低内皮细胞间通透性，保护内皮的完整，对糖尿病血管并发症内皮细胞具有明显的保护作用[8]。因此，本实验采用AGEs诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤模型，探究山茱萸环烯醚萜苷类特征成分马钱苷、莫诺苷保护内皮细胞的效应机制，为马钱苷、莫诺苷的临床应用提供理论研究基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料人脐静脉内皮细胞，购自南京凯基生物科技发展有限公司，批号: KG110；马钱苷(loganin，批号: M-010-140730 ) 、莫诺苷(morroniside，批号: M-011-140730),均由成都瑞芬思生物科技有限公司提供(质量分数≥98% ) ; 氨基胍(aminoguanidine)，Sigma公司进口分装。RPMI 1640 培养液、胰蛋白酶(Trypsin)，美国Gibco公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青公司；二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)，美国Sigma公司；RIPA裂解液，碧云天生物技术研究所；血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)ELISA试剂盒，进口分装，批号：14101201 ；单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)ELISA试剂盒，南京联科生物技术有限公司，批号：E09549-1638；一氧化氮(NO)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20140613；内皮素(ET-1)ELISA 试剂盒，进口分装，批号：14101202；RAGE抗体，美国Abcam公司，批号：GR186177-6；NF-κB抗体，美国Abcam公司，批号：GR115355-1。
1.2 仪器Synergy HT酶标仪，美国Bio-Tek公司；二氧化碳细胞培养箱，日本SANYO公司；超净工作台，苏州净化设备有限公司；倒置荧光显微镜(Ti型)，日本尼康公司。
1.3 方法 1.3.1 AGEs的制备[9]将牛血清白蛋白(BSA)在0.2 mol·L-1磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中配制成50 g·L-1，同时将葡萄糖在上述液体中配制成0.5 mol·L-1，充分溶解，37℃避光孵育3个月，使其形成AGEs-BSA。同时，平行条件下配制不加入葡萄糖的上述BSA溶液，以制备无糖基化BSA(0-BSA)作为对照。待AGEs形成后，用孔径为分子质量1万的透析袋低温透析24 h，除去未反应的葡萄糖。用0.22 μm滤器过滤除菌后保存于-20℃备用。
1.3.2 细胞培养HUVEC采用10%FBS RPMI 1640培养液培养，按1 ∶3比例进行传代培养，每2～3 d换液1次，传代至第5～7代的细胞用于实验。
1.3.3 MTT法检测细胞增殖取对数生长期的分化成熟细胞，调整细胞密度至5×107·L-1，接种于96孔板，每孔100 μL，于37℃、5% CO2培养箱中静置培养24 h。当细胞贴壁生长至80%~90%融合状态时，换无FBS RPMI 1640培养液饥饿培养23 h，加入氨基胍、马钱苷、莫诺苷(终浓度分别为100、10、1 μmol·L-1)预孵1 h后，加入终浓度为200 mg·L-1的AGEs刺激，同时设模型组和空白对照组。24 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，吸弃孔中培养上清液，每孔加入150 μL的DMSO，震荡混匀10 min，酶标仪测定490 nm处各孔的吸光度(A)值，计算细胞存活率。
细胞增殖保护率/%=[(OD给药组-OD模型组)/OD模型组]×100%
1.3.4 试剂盒检测细胞上清液中细胞因子的表达取对数生长期的HUVEC，以1×108·L-1密度接种于24孔板内，设4复孔。按“1.3.3”项中方法制备饥饿后的HUVEC，加入氨基胍、马钱苷、莫诺苷(终浓度分别为100、10、1 μmol·L-1)预孵1 h后，加入终浓度为200 mg·L-1的AGEs，同时设模型组及空白对照组。24 h后，分离细胞与上清液，用对应的试剂盒检测细胞上清液中NO、ET、MCP-1、VCAM-1水平。
1.3.5 Western blot检测RAGE、NF-κB蛋白表达取对数生长期细胞，以2×108·L-1密度接种于6孔板，按“1.3.3”项中方法制备饥饿后的HUVEC，加入氨基胍、马钱苷、莫诺苷(终浓度为10 μmol·L-1)预孵1 h后，加入终浓度为200 mg·L-1的AGEs，同时设模型组及空白对照组。离心收集细胞，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度。蛋白样品加入1/4体积的4×蛋白上样缓冲液，沸水煮沸5 min，进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后转印至PVDF膜上，按约0.1 mL·cm-2量加入封闭液封闭1 h，一抗4℃过夜。次日PBST漂洗3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育2 h，ECL显色。利用Image J软件分析各组灰度值，以β-actin为内参，计算各蛋白的变化。
1.3.6 统计学分析实验结果使用SPSS 16.0进行分析，数据以x±s表示。组间比较方差齐性采用F检验。
2 结果 2.1 马钱苷、莫诺苷对AGEs损伤HUVEC存活率的影响给予AGEs刺激24 h后，与空白对照组比较，模型组细胞OD值明显降低(P＜0.01)；与模型组比较，氨基胍组在终浓度100、10 μmol·L-1时，马钱苷、莫诺苷在终浓度100、10、1 μmol·L-1时，对AGEs损伤HUVEC具有明显的保护作用(P＜0.05～0.01)，且呈浓度相关性。见Tab 1。
| Group | Concentration /μmol·L-1 | OD490 nm | Protection rate/% |
| Vehicle | - | 0.80±0.06 | - |
| Model | - | 0.52±0.08## | - |
| Aminoguanidine | 100 | 0.69±0.04** | 32.22 |
| 10 | 0.65±0.04* | 23.63 | |
| 1 | 0.60±0.11 | 14.44 | |
| Loganin | 100 | 0.78±0.07** | 48.31 |
| 10 | 0.74±0.05** | 42.05 | |
| 1 | 0.72±0.03** | 37.05 | |
| Morroniside | 100 | 0.78±0.02** | 49.97 |
| 10 | 0.74±0.02** | 41.95 | |
| 1 | 0.71±0.03** | 34.89 | |
| ##P＜0.01 vs vehicle;*P＜0.05,**P＜0.01 vs model | |||
给予AGEs刺激24h后，与空白对照组比较，模型组细胞产生的MCP-1、VCAM-1明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，氨基胍、莫诺苷、马钱苷(终浓度为100、10、1 μmol·L-1)对AGEs损伤HUVEC细胞产生的MCP-1、VCAM-1具有明显的抑制作用(P＜0.05～0.01)。见Tab 2。
| Group | Concentration /μmol·L-1 | MCP-1 /μg·L-1 | VCAM-1 /μg·L-1 |
| Vehicle | - | 246.75±72.15 | 0.72±0.06 |
| Model | - | 580.50±50.74## | 1.05±0.08## |
| Aminoguanidine | 100 | 344.20±38.38** | 0.68±0.11** |
| 10 | 370.50±63.57** | 0.73±0.17* | |
| 1 | 423.00±46.73** | 0.82±0.11* | |
| Loganin | 100 | 334.20±31.19** | 0.72±0.09** |
| 10 | 368.00±12.25** | 0.83±0.09* | |
| 1 | 400.50±26.61** | 0.89±0.13 | |
| Morroniside | 100 | 323.00±42.43** | 0.71±0.06** |
| 10 | 345.50±16.58** | 0.85±0.09* | |
| 1 | 379.20±23.23** | 0.91±0.04* | |
| ##P＜0.01 vs vehicle;*P＜0.05,**P＜0.01 vs model | |||
给予AGEs刺激24 h后，与空白对照组比较，模型组细胞产生的NO明显降低(P＜0.01),ET-1明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，氨基胍、马钱苷、莫诺苷(终浓度为100、10、1 μmol·L-1)对AGEs损伤HUVEC细胞产生的NO具有明显的促进作用(P＜0.01);氨基胍(终浓度为100、10、1 μmol·L-1)、马钱苷(终浓度为100、10 μmol·L-1)、莫诺苷(终浓度为100 μmol·L-1)对AGEs损伤HUVEC细胞产生的ET-1具有明显的抑制作用(P＜0.05～0.01)。见Tab 3。
| Group | Concentration /μmol·L-1 | NO/ μmol·L-1 | ET-1/ μg·L-1 |
| Vehicle | - | 497.19±15.76 | 13.87±1.80 |
| Model | - | 436.87±18.27## | 20.08±2.16## |
| Aminoguanidine | 100 | 519.37±3.89** | 14.51±1.31** |
| 10 | 495.00±7.14** | 14.81±3.39* | |
| 1 | 492.19±5.98** | 15.32±1.14** | |
| Loganin | 100 | 635.62±14.01** | 12.76±1.28** |
| 10 | 584.06±8.92** | 15.87±2.06* | |
| 1 | 547.19±9.26** | 17.43±3.55 | |
| Morroniside | 100 | 653.12±16.79** | 14.00±2.05** |
| 10 | 649.37±18.78** | 15.80±4.25 | |
| 1 | 619.69±7.99** | 16.34±3.01 | |
| ##P＜0.01 vs vehicle;*P＜0.05,**P＜0.01 vs model | |||
给予AGEs刺激24 h后，与空白对照组比较，模型组RAGE、NF-κB蛋白表达明显增加(P＜0.01)；与模型组比较，氨基胍、马钱苷、莫诺苷组(终浓度为10 μmol·L-1)的RAGE、NF-κB蛋白表达明显下调(P＜0.05～0.01)。见Fig 1、Fig 2。
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| Fig 1 Effect of loganin and morroniside on expression of RAGE in HUVECs(x±s,n=3) ##P＜0.01 vs vehicle;*P＜0.05,**P＜0.01 vs model |
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| Fig 2 Effect of loganin and morroniside on expression of NF-κB in HUVECs(x±s,n=3) ##P＜0.01 vs vehicle;**P＜0.01 vs model |
血管内皮细胞作为一种机体内的重要修复细胞，其主要功能有愈合创面、参与炎症反应、分泌细胞外基质、生长因子等[10]。研究表明[11]，血管内皮功能紊乱是糖尿病血管并发症的关键性环节。AGEs是非酶糖基化反应的终末产物，糖尿病条件下AGEs形成速率加快并大量累积，因此，糖基终末化产物受体(RAGE)与AGEs结合增多及活性增强，诱导NF-κB的活化，并由胞质转移到胞核中，启动多种靶基因的转录[12]，影响MCP-1、VCAM-1等表达，进而引起内皮细胞炎症反应的发生。另外，还可影响NO/ET 的平衡[13]，改变内皮细胞功能，引起细胞膜通透性的变化。NF-κB激活后又作为一种正反馈，促进AGEs与RAGE的结合。
越来越多的证据表明，炎症反应是引起糖尿病血管病变的重要因素之一。MCP-1是趋化因子超家族CC亚群的成员之一，具有诱导、激活单核巨噬细胞的作用。正常情况下，HUVEC等多种机体细胞分泌少量MCP-1，在机体内保持平衡，维持正常生理功能。但在糖尿病条件时，多种因素诱导内皮细胞趋化因子表达增强，MCP-1分泌增多[14]。 MCP-1还可促进HUVEC表达VCAM-1，后者可介导HUVEC和白细胞黏附紧密,并相互作用、相互激活,促进黏附分子、趋化因子、细胞因子大量表达,扩大炎症反应[15]。因此，MCP-1和VCAM-1介导的单核细胞迁移和对内皮细胞的黏附是诱发血管内炎性反应的关键步骤，是衡量病变过程中炎性反应程度的特征指标。NO和内皮素(ET-1)是一对调节血管舒张收缩功能的活性物质，ET-1的升高及NO的降低，可引起血管收缩、微循环障碍，从而导致血管内皮依赖性舒张功能减退。NO是内源性血管舒张因子，因此血管内NO降低，是糖尿病血管病变的发病机制之一。ET-1是一种具有强烈收缩血管作用的活性多肽，它是由血管内皮细胞分泌的所知作用最强、最持久的缩血管多肽物质，在内皮损伤时,ET-1的合成与释放明显增加,故被认为是血管内皮功能损伤的分子标志物之一[16]。研究表明,NO与ET-1的动态平衡对于内皮功能的调节至关重要。因此，NO 与ET-1含量变化是反映内皮细胞功能改变的重要指标之一。
本实验通过AGEs直接刺激HUVEC 24h，研究马钱苷、莫诺苷对AGEs损伤HUVEC的保护作用，并探讨其作用机制。结果表明，马钱苷、莫诺苷可减轻AGEs诱导的HUVEC损伤，并促进HUVEC的增殖，且随着浓度的升高而增强；同时，马钱苷、莫诺苷可明显下调HUVEC中RAGE蛋白的表达，提示马钱苷、莫诺苷保护HUVEC损伤可能与降低RAGE表达有关。NF-κB为介导炎症反应的启动因子，马钱苷、莫诺苷可有效抑制NF-κB的表达，减少MCP-1和VCAM-1的分泌，抑制炎性反应。另外，马钱苷、莫诺苷可恢复NO和ET-1间的动态平衡，改善内皮细胞功能。综上所述，马钱苷、莫诺苷对AGEs诱导的HUVEC损伤具有保护作用，其机制可能为下调RAGE蛋白表达，抑制RAGE受体相关NF-κB信号通路发挥抗炎作用，从而改善内皮细胞功能。
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