2. 新疆医科大学中心实验室，新疆 乌鲁木齐 830011
2. Central Laboratory, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011,China
已有资料显示，许多疾病的发生发展与机体的免疫功能紊乱有关，免疫功能的失调往往导致机体各种组织器官的损伤[1]。目前，在免疫学研究领域上，常用环磷酰胺(cyclophosphamide,Cy)复制免疫抑制动物模型，评价一些中西医药物对免疫功能紊乱性疾病的疗效，但是Cy导致免疫抑制的物质基础及全身代谢变化特点还不清楚。代谢组学(metabonomic)是研究生物体内源性某些特殊意义的代谢产物的质和量的变化规律，从微观角度区分不同的代谢状态，并根据不同的代谢表型区分出不同的内外因素对机体的作用方式，反映机体内生理和病理变化过程[2-3]。因此，本实验采用1H核磁共振代谢组学技术，观察Cy诱导的免疫抑制小鼠血清中特异性代谢物，从代谢水平探讨该模型的形成机制，期望能为以后的临床诊断和疗效评价提供新的实验依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 动物6周龄SPF级♂昆明小鼠20只，平均体质量为(20±2)g，购自新疆医科大学动物实验中心，动物生产许可证号：SCXK(新)2011-0004，实验动物实施许可证号：SYXK(新)2011-0001。
1.1.2 仪器设备Inova600 MHz 超导核磁共振波谱仪(美国瓦里安公司)；流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；低温离心机(德国Eppendorf公司)；电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)。
1.1.3 药物与试剂Cy购自Sigma公司；重水(Deuterium oxide)购自北京百灵威科技有限公司；氯化钠分析纯(NaCl)购自天津永晟精细化工有限公司；磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)购自天津市福晨化学试剂厂；抗小鼠CD4(FITC标记)、CD8(PE/cy5标记)的荧光抗体，购自Biolegend公司；红细胞裂解液购自Beckman Coulter公司；磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司。
1.2 方法 1.2.1 分组与造模将20只♂ KM小鼠，随机分成正常组和模型组，各组10只。动物模型的建立参照文献[4]，以小剂量多次给药方式进行，即正常组腹腔注射生理盐水，模型组将Cy以50 mg·kg-1的量连续腹腔注射7 d造模，造模成功后，以40 mg·kg-1的量每5 d腹腔注射1次维持免疫低下模型，并连续到30 d。
1.2.2 确认造模成功 1.2.2.1 T细胞亚群(CD4+T、CD8+T、CD4/CD8)的测定[5]采眼静脉血至EDTA抗凝管中，并取100 μL抗凝血，分别加0.5 μL和1.25 μL的CD4、CD8荧光抗体，室温孵育30 min后，加0.5 mL红细胞裂解液作用5~10 min，血液变透明后加1 mL PBS溶液离心(1 000 r·min-1，5 min)，弃上清，再加0.5 mL PBS溶液重悬细胞后上流式细胞仪检测。
1.2.2.2 统计学方法SPSS 17.0软件处理数据，实验数据用x±s表示，两个独立样本t检验进行比较。
1.2.3 代谢组学检测及分析[6] 1.2.3.1 至样品的采集与处理小鼠空腹12 h后，采眼静脉血至离心管中，并以3 000 r·min-1的速度离心10 min分离血清，取200 μL血清，混于400 μL 的磷酸缓冲液(用重水将0.9 g的NaCl、0.8298 g的K2HPO4、0.1418 g的NaH2PO4配成100 mL，pH值为7.4)，室温放置10 min后，低温离心机4℃，10 000 r·min-1的速度离心10 min，取550 μL上清液加入到5 mm核磁管中。
1.2.3.2 血清1H-NMR谱图测定将Inova 600型核磁共振波谱仪调用弛豫编辑脉冲序列(Carr-Purcell-Meiboom-Gill,CPMG脉冲序列)(relaxation delay-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ)进行测定。测定条件与参考文献推荐的步骤[6]一致，采用预饱和方式抑制水峰。选出在一维谱中质量较好的样品进行二维谱测试，指认谱网中各种峰。
1.2.3.3 氢谱数据分析和代谢标志物鉴定采用线宽为0.3Hz的指数窗函数，对血清1H-NMR图谱进行傅里叶变换后，用Topspin2.0软件进行基线校正，并以a-D葡萄糖5.233 ppm的质子信号为标准定标。对CPMG数据将范围为δH=9.0~0.5 ppm区域的所有图谱以每0.003 ppm段设为一个积分段进行自动积分，并删掉在5.21~4.68 ppm范围内的水峰区域。将剩余积分值进行归一化处理之后，用SIMCA-P+11软件进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA分析)，并通过自动规格化处理(UV)进行模式质量评价，具体用R2X、R2Y、Q2等指标进行质量评价，其中R2X表示X的变异百分比，R2Y表示Y的变异百分比，Q2表示累计预测结果的真实性，即Q2>0.4时认为预测结果可接受，Q2＞0.9时预测结果更可靠。根据最小样本量(本次实验中由于模型组中3只小鼠死亡，最小样本量定为7只)将OPLS-DA分析所得相关系数|r|值的显著性阈值定为0.707，如|r|>0.707可视为该代谢物在两组间差异有显著性(P<0.05)，|r|越接近于l表示其差异性越大，反之越小，相关系数的正值或负值表示代谢物的增多或减少趋势。
2 结果 2.1 两组小鼠T细胞亚群的比较Tab 1结果显示，与正常组相比，模型组小鼠CD4+T细胞百分率和CD4/CD8比值明显降低(P<0.05)，提示造模成功。
| Group | CD4+T/% CD8+T/% | CD4/CD8 | |
| Control | 38.44±3.71 | 8.59±1.41 | 4.57±0.81 |
| Model | 25.44±3.93 | 9.71±2.11 | 2.73±0.68 |
| t | 7.605 | 1.399 | 5.511 |
| P | 0.000 | 0.179 | 0.000 |
从OPLS-DA分析得到的平面分布图和3D空间分布图可见，所有样本均分布在95%的置信区间内，两组分布区域完全分开，而且该分析模型具有很好的可解释性(R2X=0.375，R2Y=0.921)及可预测性(Q2=0.616)，因此认为两组的血清代谢物有一定差异性(Fig 1)。根据OPLS-DA分析所得的相关系数，确定两组小鼠血清差异性代谢成分的化学位移与差异程度，即与正常组比较，有差异代谢物的相关系数正值表示该代谢物在模型组小鼠血清中为升高的代谢物，反之亦然。从Tab 2可看出，与正常组比较，模型组小鼠血清中亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、乳酸、甘氨酸、肌酸、蛋氨酸、缬氨酸、β-羟丁酸、肉碱、色氨酸等代谢物含量增多，糖蛋白、不饱和脂类、丙酮、VLDL、LDL、谷氨酰胺含量减少，差异有统计学意义(P<0.05)。
|
| Fig 1 OPLS-DA score plot(A) and 3D plot (B) derived from 1H-NMR spectra of serum in normal group(■) and Cy model group(●) |
| No Metabolites | Attribution | Chemicalshift/ppm correlation | coefficient/r |
| 1 Leucine | β-CH2,α-CH | 1.72(m),3.68(dd) | 0.74 |
| 2 Alanine | CH3,α-CH | 3.76(q) | 0.81 |
| 3 Glycoprotein | NHCO-CH3 | 2.03 | -0.76 |
| 4 Glutamine | Halfβ-CH2,Halfβ-CH2,α-CH | 2.10(m),2.14(m),3.76(m) | -0.82 |
| 5 Tyrosine | α-CH | 3.95(dd) | 0.92 |
| 6 Histidine | α-CH | 3.98(dd) | 0.81 |
| 7 Lacticacid | CH | 4.11(q) | 0.78 |
| 8 Glycine | CH2 | 3.55(s) | 0.73 |
| 9 Creatine | CH2 | 3.93(s) | 0.87 |
| 10 Unsaturatedlipid | =CHCH2CH=, | 5.26(m) | -0.83 |
| =CHCH2CH2=, | 5.25(m) | ||
| =CHCH2CH2=, | 5.30(m) | ||
| =CHCH2CH2=, | 5.32(m) | ||
| 11 Lowdensitylipoprotein(LDL) | CH3CH2CH2C=,CH3CH2(CH2)n,CH2C=C | 0.88(m), | -0.87 |
| 1.27(m), | |||
| 2.00(m) | |||
| 12 Acetone CH3 | 2.22(s) | -0.84 | |
| 13 Verylowdensitylipoprotein(VLDL)CH3CH2(CH2)n | 1.26(m) | -0.86 | |
| 14 Methionine | β-CH2,S-CH3, | 2.10(m),2.13(s), | 0.84 |
| α-CH2 | 3,87(m) | ||
| 15 Valine | α-CH2 | 3.60(d) | 0.77 |
| 16 Β-hydroxybutyricacid | β-CH | 4.16(d) | 0.75 |
| 17 Carnitine | CH2(COO) | 2.46(dd) | 0.76 |
| S:singlet; d:doublet; dd:doublet of doublets; m:multiplet; q:quartet | |||
环磷酰胺是临床上常用的治疗恶性肿瘤的一种烷化剂，其通过与DNA非特异性的结合，使DNA变形、失活，表现出非特异性细胞毒性作用，特别是对骨髓造血组织、淋巴组织等增殖分化较快组织的细胞毒性作用较大，能通过影响DNA合成进而抑制RNA和蛋白质合成，此外，还具有很强的肝肾毒性[7]。本次实验中免疫抑制模型小鼠体内谷氨酰胺、糖蛋白、不饱和脂类、VLDL、LDL、丙酮、亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、乳酸、甘氨酸、肌酸、蛋氨酸、缬氨酸、β-羟丁酸和肉碱等17种代谢物均发生变化，而这些代谢物的改变一定程度上反映了Cy在小鼠体内诱发的一系列病理变化过程。
谷氨酰胺是体内许多组织合成的非必需氨基酸，其具有减少组织、器官的自由基损伤，提高机体的抗氧化能力和保护肠道黏膜的作用[8]。因此，体内谷氨酰胺含量的下降能加剧机体的氧化损伤和免疫力的进行性下降。糖蛋白参与细胞识别功能的同时，也是细胞造血等机体生理功能中必不可少的蛋白质，具有保护上皮细胞的完整性、增加淋巴细胞数和增强免疫力的功能[9]。糖蛋白的下降表示上皮细胞受到损伤。总的来讲，血清中谷氨酰胺、糖蛋白含量的下降是细胞膜受到损伤，机体自由基损伤加重，免疫力下降的预示。本实验中模型组小鼠血清谷氨酰胺和糖蛋白含量降低，明确显示出Cy的免疫抑制作用。另外，模型组小鼠血清中亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、色氨酸和丙氨酸含量增多，提示这些氨基酸是在机体免疫力降低等高分解状态下形成量增多[10]，表明Cy引起的细胞损伤加速了蛋白质的分解而抑制了蛋白质的合成。
β-羟丁酸和丙酮是脂肪酸在肝细胞线粒体内β-氧化所产生的中间物，肉碱是脂肪酸β-氧化过程中将活化的脂酰CoA从细胞液转入到线粒体必不可少的转运体[11-12]。丙酮可在一系列酶的催化下转变为丙酮酸或乳酸，也可随尿排出或经肺呼出体外，而β-羟丁酸是酸性物质，其含量的增多能导致酮症酸中毒。因此，β-羟丁酸和肉碱含量的升高可预示体内脂肪酸β-氧化过程的加剧。本实验中模型组小鼠血清中β-羟丁酸、肉碱含量升高，丙酮含量减少，可认为免疫抑制小鼠体内脂肪酸β-氧化过程加剧。血清中的不饱和脂类、VLDL、LDL是脂肪分解的产物，其中VLDL是在肝细胞中生成，LDL是在血浆内由VLDL转变而产生[13]。分析血清中不饱和脂类、VLDL、LDL含量的降低可能是由于以下原因引起：① 体内载脂蛋白质合成减少，使肝细胞合成的三酰甘油不能及时释放出血液内；② 小鼠对脂类化合物利用率的下降；③ 肌酸具有降低胆固醇、极低密度脂蛋白和甘油三酯的作用[14]，因此肌酸含量的增多与VLDL和LDL含量的下降有关；④ 脂肪酸β-氧化过程的加剧使VLDL、LDL合成原料减少[15]。而体内不饱和脂类、VLDL、LDL水平是反映机体脂肪动员水平的重要指标，因此模型组小鼠血清中不饱和脂类、VLDL、LDL含量的下降提示免疫抑制小鼠体内脂肪动员的抑制。
乳酸是糖酵解过程的终产物，在炎症、吞噬细胞侵入、严重贫血、呼吸障碍、循环障碍、肾或肝等组织局部损伤或缺氧时，由于血管明显扩张，血管内皮受损，大量的液体从血管内渗出到组织间隙，产生局部供血不足和缺氧，导致机体糖酵解加速[16-17]。本次实验中模型组小鼠体内乳酸含量增多，可能是由于Cy骨髓抑制作用所诱发的贫血和肝肾组织损伤而引起的。当然，脂肪酸β-氧化产物丙酮含量降低也对乳酸含量增多有一定影响。另外，脂肪、糖类和氨基酸均是通过各种反应参与能量代谢，本实验中脂肪酸β-氧化和糖酵解过程的加剧[15]、脂肪动员的抑制[18]可能预示免疫抑制小鼠体内能量产生不足，导致动物机体长时间处于耗能状态，这可能是Cy免疫抑制小鼠形体消瘦、懒怠的原因之一。
综上，Cy引起免疫抑制的病理机制涉及到机体的氨基酸代谢、脂肪代谢、糖代谢和能量代谢的紊乱，表现出整体机能的平衡失调，使机体处于免疫功能紊乱的状态。
( 致谢: 本次实验在新疆医科大学动物实验中心和新疆医科大学核磁共振实验室完成，在此特别感谢支持经济和学术指导方面的阿里木·帕塔尔教授，动物实验中心的王忠老师和核磁共振实验室的巴吐尔·买买提明老师 )
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