2. 暨南大学药学院新药研究所，广东 广州 510632
2. Institute of New Drug Research，College of Pharmacy，Jinan University, Guangzhou 510632，China
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种常见的神经退行性疾病，主要表现为记忆力减退、认知功能障碍等精神症状[1-2]。AD 典型的病理变化包括大脑组织中老年斑沉积(主要由Aβ蛋白形成)，神经元纤维缠结和胆碱能神经元丢失[3]。AD的发病机制目前仍未完全阐明，“Aβ级联学说”是目前较为公认的AD 发病学说之一[3-4]，该学说认为，AD发生时，Aβ蛋白异常沉积引起一系列级联反应，包括氧化应激毒性、神经炎症、钙稳态破坏等，直接或间接地损伤神经元细胞，导致Aβ沉积，周围胆碱能神经元数量减少，从而产生记忆损伤。
目前国内外批准用于AD治疗的药物多为胆碱酯酶抑制剂，代表药为多奈哌齐，其主要通过抑制乙酰胆碱酯酶活性而抑制乙酰胆碱降解，增加局部乙酰胆碱浓度，从而改善神经递质传递功能。但多奈哌齐只针对轻、中度AD，随着病程发展，功能完整的胆碱能神经元数量减少，多奈哌齐的作用也会随之减弱。因此，开发治疗AD 的新型药物十分重要。川芎嗪(TMP)来源于中药川芎的干燥根茎，具有抗炎、抗氧化和抑制细胞凋亡等多方面药理作用，但生物利用度不高[5]。J147是美国索克生物研究所合成的化合物，具有保护神经突触功能的作用[6]。T-006是我们将TMP分子连接到J147上，经过结构修饰而得到的新型化合物，前期体外实验证明，T-006在应激细胞模型中可表现出明显的抗氧化应激作用，可保护神经细胞免于损伤[5]，提示该化合物有可能成为治疗AD的新型药物。本研究以东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍作为模型，就T-006对该模型中小鼠学习记忆障碍的改善作用及其可能机制进行初步探讨。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器T-006由暨南大学药学院合成；多奈哌齐由浙江海正药业股份有限公司提供；氢溴酸东莨菪碱和AchE试剂盒均购自Sigma公司；SOD试剂盒、GSH试剂盒、MDA试剂盒及考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Morris水迷宫测试系统购自淮北正华生物仪器设备有限公司；酶标仪购自美国Biotek公司。
1.2 动物与分组健康♂成年昆明小鼠72只，体质量(20±2) g，由南方医科大学实验动物中心提供[SPF级，许可证号SCXK(粤) 2011-0015]。动物随机分为6组：正常对照组、模型组(给予东莨菪碱)、阳性药对照组(多奈哌齐+东莨菪碱)、T-006组(T-006+东莨菪碱，包括T-006 1 mg·kg-1组、T-006 3 mg·kg-1组和T-006 10 mg·kg-1组)，每组12只。随机分组后d 2开始给药，连续给药14 d，实验流程图见Fig 1。每只小鼠采用灌胃方式给药，正常组与模型组灌胃给予相应剂量的药物溶剂(0.64 mol·L-1 DMSO)。
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| Fig 1 Flowchart of animal experiments |
模型组、阳性药对照组和T-006 3个剂量组分别在水迷宫实验时小鼠入水前20 min腹腔注射2 mg·kg-1东莨菪碱造成记忆障碍，正常对照组小鼠注射相应剂量无菌生理盐水。
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| Fig 2 Results of Morris water maze assays (n=12) 1:Control;2:Model;3:Donepezil;4:T-006 1 mg·kg-1;5:T-006 3 mg·kg-1;6:T-006 10 mg·kg-1;*P＜0.05 vs model group. |
实验方法参照文献[7]，并作适当修改。实验时间总共5 d，以定位航行、空间探索为指标。定位航行实验连续进行4 d，观察和记录实验动物寻找并爬上隐藏平台所需时间。最后1 d(水迷宫实验d 5)进行空间探索实验，记录动物第1次到达原平台位置的时间(即潜伏期)、穿越平台位置的次数以及在目标象限活动的时间和路程。
1.5 乙酰胆碱酯酶活性的测定Morris水迷宫实验结束后，立即对小鼠进行麻醉，以冰冷生理盐水灌流后将动物断头取脑、分离海马和皮层。分别按海马和皮层重量加9倍蛋白裂解液制备脑组织匀浆，10 000×g离心30 min，取上清于-20℃冰箱保存。根据Sigma乙酰胆碱酯酶活性测试盒的说明书测定乙酰胆碱酯酶活性，用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。
1.6 SOD活性及GSH、MDA含量测定按上述方法制备海马和皮层组织匀浆，10 000×g离心30 min，取上清液置于-20℃冰箱保存。根据南京建成生物工程研究所提供的SOD活性、GSH含量和MDA含量测定说明书，测定SOD活性及GSH和MDA含量，用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。
1.7 数据的分析与统计采用GraphPad Prism 6.0统计软件对结果进行分析，所有数值均采用 ±s表示，所有结果均采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 水迷宫实验结果定位航行实验结果中，随着实验的进行，正常对照组动物找到隐藏平台时间逐渐缩短，表明该训练方法有效。与正常对照组相比，模型组动物找到平台时间的平均值无明显变化，表明东莨菪碱致记忆障碍模型建模成功；与模型组相比，多奈哌齐组动物找到平台时间的平均值明显缩短，表明阳性药多奈哌齐在该模型中可以有效逆转东莨菪碱造成的学习记忆障碍；与模型组相比，T-006 3个剂量组动物找到平台时间均值明显缩短(P＜0.05)，效果与多奈哌齐相当，见Fig 2A。
水迷宫空间探索实验结果中，与正常对照组相比，模型组动物潜伏期明显延长(P＜0.05)，多奈哌齐组动物潜伏期与模型组相比明显缩短(P＜0.05)，T-006 3个剂量组动物潜伏期与模型组相比明显缩短(P＜0.05)，见Fig 2B。与正常对照组相比，模型组动物穿越平台区域次数明显减少(P＜0.05)，多奈哌齐组动物穿越平台次数与模型组相比明显增加(P＜0.05)，T-006 3个剂量组动物穿越平台次数与模型组相比明显增加(P＜0.05)，见Fig 2C。与正常对照组相比，模型组动物在目标象限游泳路程明显减少(P＜0.05)，多奈哌齐组动物在目标象限路程与模型组相比明显增加(P＜0.05)，T-006 3个剂量组动物在目标象限路程与模型组相比明显增加(P＜0.05)，见Fig 2D。与正常对照组相比，模型组动物在目标象限活动时间明显减少(P＜0.05)，多奈哌齐组动物目标象限活动时间与模型组相比明显增加(P＜0.05)，T-006 3个剂量组动物目标象限活动时间与模型组相比明显增加(P＜0.05)，见Fig 2E；各组动物之间的平均游泳速度没有明显差异(P>0.05)，排除了动物体力差异对结果的影响，见Fig 2F。
2.2 乙酰胆碱酯酶(AchE)活性测定结果与正常对照组相比，模型组海马和皮层中AChE活性均明显升高(P＜0.05)。在海马组织中，与模型组相比，T-006(10 mg·kg-1)组和多奈哌齐组AChE 活性明显降低(P＜0.05)；在皮层组织中，与模型组相比，T-006(1、3、10 mg·kg-1)组和多奈哌齐组AChE 活性明显降低(P＜0.05)，见Fig 3。
2.3 GSH、SOD及MDA含量测定结果 2.3.1 SOD测定结果
与正常对照组相比，模型组小鼠海马和皮层SOD活性明显降低(P＜0.05)；与模型组相比，多奈哌齐组海马和皮层SOD活性无明显升高(P>0.05)，T-006(1、3、10 mg·kg-1)组海马和皮层SOD活性明显升高(P＜0.05)；与多奈哌齐组相比，T-006(10 mg·kg-1)可明显升高海马SOD活性(P＜0.05) ，见Fig 4。
与正常对照组相比，模型组小鼠海马和皮层GSH含量明显降低(P＜0.05)；与模型组相比，多奈哌齐组海马和皮层GSH含量无明显升高(P>0.05)；与模型组相比，T-006(3、10 mg·kg-1)组海马GSH含量明显升高(P＜0.05)，T-006(1、3、10 mg·kg-1)组皮层GSH含量明显升高(P＜0.05)；与多奈哌齐组相比，T-006(10 mg·kg-1)可明显升高海马GSH含量(P＜0.05) ，见Fig 5。
与正常对照组相比，模型组小鼠海马和皮层MDA含量明显增高(P＜0.05)；与模型组相比，多奈哌齐组海马和皮层MDA含量无明显降低(P>0.05)；与模型组相比，T-006(3、 10mg·kg-1)组海马和皮层MDA含量明显降低(P＜0.05)；与多奈哌齐组相比，T-006(3、10 mg·kg-1)可明显降低皮层MDA含量(P＜0.05)，见Fig 6。
本实验使用东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍作为模型，东莨菪碱是乙酰胆碱的竞争性拮抗剂，小鼠腹腔注射东莨菪碱能阻滞M胆碱受体传递，模拟乙酰胆碱分泌不足造成的可逆性学习记忆障碍[9-10]。因此，东莨菪碱所致学习记忆障碍模型被认为是AD药物研究经典的初筛模型。本研究在该模型上评价了新型化合物T-006对动物学习记忆的影响，实验结果表明，T-006可明显改善痴呆模型动物的学习记忆能力；同时发现，T-006作用机制可能与抗氧化应激作用和抑制乙酰胆碱酯酶活性有关。
AD的发病机制至今尚未被完全阐明，目前公认的AD发病假说有“Aβ级联假说”和“胆碱能假说”。Aβ级联假说认为，脑组织中沉积的Aβ蛋白会产生一系列的细胞级联反应，作用于胆碱能神经元细胞，其中包括氧化应激损伤[4]，而SOD、GSH和MDA是反映机体氧化还原状态的主要标志物[8, 11]；AD胆碱能假说认为，乙酰胆碱酯酶活性升高会导致中枢乙酰胆碱含量降低，影响神经递质传递，从而导致学习记忆障碍[12-14]。本实验结果显示，T-006可显著升高脑组织中SOD、GSH含量，降低MDA含量，且效果优于多奈哌，并且T-006可有效拮抗东莨菪碱引起的乙酰胆碱酯酶含量升高，提示T-006的作用还可能与增强脑内中枢胆碱能系统功能有关。
T-006是一种经过筛选得到的具有开发价值的新型化合物，其化学结构不同于多奈哌齐等传统单靶点药物，而是来源于多功能的中药单体，故T-006应具有多方面药理活性。本研究首次发现，T-006具有多方面药理作用，其增强学习记忆能力的机制可能与抑制乙酰胆碱酯酶合成，从而减少乙酰胆碱分解，提高脑内乙酰胆碱水平有关; 并且该化合物也可能通过抗氧化损伤作用，保护胆碱能神经元，改善胆碱能系统功能，从而促进学习记忆能力。综上所述，T-006是一种有前景的多靶点AD治疗新药，但仍需运用其它能够多方面模拟AD病理特征的模型，如大鼠侧脑室注射Aβ蛋白模型和APP/PS1双转基因小鼠模型，对其药效进行进一步验证并探究其深层次的机制。
( 致谢: 本实验由中山大学中山医学院药理教研室陶亮课题组完成，受试药T-006由暨南大学药学院新药研究所提供。实验参与人员有：宋奇，吴韦黎，邵敏，张宇。 )
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