2. 澳门大学中华医药研究院中药质量研究国家重点实验室，澳门 999078;
3. 暨南大学药学院新药研究所，广东 广州 510632
2. 2. State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Macao 999078, China ;
3. Institute of New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China
川芎和丹参是我国传统医学中广泛应用的中药，我们的meta分析研究结果表明，丹参川芎注射液对心绞痛有良好的治疗效果[1]，其中的主要成分丹参素(DSS)和川芎嗪(TMP)是预防或治疗心脑血管疾病的活性物质。但是，这些中药单体疗效不强，且作用机制不明确，限制了其进一步的应用。为了提高丹参素的治疗效果，充分发挥其药效特色，我们对川芎嗪和丹参素进行了系统的化学结构修饰、药效和作用机制研究。我们发现丹参素与活性分子川芎嗪偶联修饰后得到的化合物ADTM(Fig 1A)[2]，其化合物的作用与临床上用的药物治疗效果相似，但具有比临床的药物作用范围更广阔和毒性小等特点[3]。同时，本课题组尚未发表的实验结果表明，ADTM在体内外对神经毒素6-羟基多巴胺诱导的帕金森综合症有明显的保护作用。其次，利用化学蛋白质组学的方法，找到了该化合物的药物作用靶点[4, 5]。
斑马鱼是一种用来研究器官发育和疾病模型的常见模式生物之一，具有胚胎透明、可直接观察内部器官、受试品用量少、筛选周期短和实验操作简便等独特优势。作为小型体内实验动物模型，斑马鱼在分子水平上85%与人类相同，心血管系统早期发育极为相似。48 hpf(受精后小时)背动脉与轴静脉形成简单循环网，72 hpf功能性管脉系统形成，肠下静脉血管(SIVs)呈现，在促血管新生药物筛选方面得到广泛的应用[6, 7]。本研究用转基因斑马鱼研究ADTM对血管新生的干预作用。
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| Fig 1 Schematic illustration of experimental plan in normal zebrafish A:Chemical structure of ADTM;B:A schematic illustration of drug treatment in normal zebrafish;C:Lateral view of vascular-specific transgenic zebrafish,the part indicated by dashed line represents SIV. |
血管转基因斑马鱼Tg(fli1:EGFP)和Tg(fli1:nEGFP)购于国际斑马鱼资源中心，斑马鱼按照发表的方法饲养与繁殖[8]。这两种转基因斑马鱼分别在血管和血管的内皮细胞核表达绿色荧光蛋白。
1.2 化合物丹参素衍生物ADTM按照发表的文章合成(纯度＞98%)[2]；血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VRI)购于Calbiochem公司(货号：676481)。
1.3 动物分组与药物处理 1.3.1 ADTM对正常斑马鱼模型的影响选择状态良好，发育至48 h受精后的血管转基因斑马鱼Tg(fli1:EGFP)胚胎，将其放入28.5℃培养基的12孔培养板中，每孔12个胚胎。以0.1%的DMSO为空白对照，以50、100、200 μmol·L-1的ADTM为药物处理组。药物作用48 h后，在荧光显微镜下观察不同浓度ADTM对斑马鱼SIVs的影响(Fig 1B)。
1.3.2 ADTM对VRI诱导血管损伤斑马鱼模型的影响选择状态良好、发育至22 h的血管转基因斑马鱼胚胎，将其放入28.5℃培养液的12孔板中，每孔12个胚胎。预先加入VRI 300 nmol·L-1，在28.5 ℃培养箱内孵育3 h，用培养液洗3遍后，加入培养基继续培养21 h后(此时，VRI处理后的斑马鱼，表现为SIV缺失)，分别加入50、100、200 μmol·L-1的ADTM为药物处理组，以单独加0.1% DMSO为空白对照组。培养48 h后，在荧光显微镜下观察药物对斑马鱼ISVs的影响。
1.3.3 观察方法按照本课题组发表的方法观察血管生成情况，并进行定量分析[9, 10]，用软件AxiovisionLE 4.1测量随机选取的3条斑马鱼的SIVs直径(Fig 1C)。关于斑马鱼SIVs内皮细胞的数量的计算，采用直接计数的方法实现。在VRI诱导血管损伤模型中，我们将从主动脉(DA)或者脊椎主静脉(PCV)发芽延伸并连接到背部脊索血管(DLAVs)的ISVs定义为完整血管(intact)，而一些已经从DA或者PCV延伸出，但是并无与DLAVs相连的ISVs定义为缺陷型血管(defective)，然后分别对每条斑马鱼的完整型和缺陷型血管进行统计分析。
1.3.4 统计学方法每组12条斑马鱼，结果用x±s表示，均数间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。
1.4 提取斑马鱼幼鱼的总RNA药物处理后，用总RNA抽提试剂盒(RNeasy Mini kit,QIAGEN，德国)进行RNA提取，提取药物处理组(VRI+ADTM)与模型组(VRI)各30条斑马鱼幼鱼总RNA。质量鉴定合格后，进行斑马鱼幼鱼转录组的测定。
1.5 斑马鱼转录组的测定及其分析参照本课题组前期报道的方法[11]，对斑马鱼的转录组进行测序和生物信息学数据分析。首先在Illumina Hi-2000基因组分析平台上进行双端测序；对末端RNA序列进行了配对，用Illumina基因组分析仪的fasta格式处理数据；用Cuffdiff软件进行差异基因分析；在DAVID数据库中对差异表达基因进行GO功能注释、分析和KEGG pathway显著性富集分析。
1.6 斑马鱼转录组测序数据的验证为了验证斑马鱼转录组测序数据的准确性，从转录组的基因表达谱中选取了4个基因(GSK-3β、BRAF、Sema3ab和IL1B)，按照报道的方法[11]，用RNA为模版，用随机引物进行反转录，合成cDNA第一条链，然后设计特异性引物进行荧光定量PCR(qPCR)分析。
2 结果 2.1 ADTM对正常斑马鱼血管新生的影响不同浓度药物处理组斑马鱼胚胎48 h后，SIVs的直径明显增加，并呈现剂量依赖关系(Fig 2)。药物处理组与对照组比较有统计学意义(P<0.05)，该结果初步表明ADTM具有促血管生成活性的作用。血管内皮细胞是构成血管的最主要的细胞之一，我们采用内皮细胞核转基因斑马鱼研究ADTM对内皮细胞数量的影响。结果表明(Fig 3)，不同浓度药物处理组斑马鱼胚胎48 h后，SIVs内皮细胞数量微弱增加，药物处理组与对照组比较没有统计学意义(P>0.05)。
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| Fig 2 Effects of ADTM on diameters of zebrafish SIVs(x±s,n=12) A: embryo treated with 0.1％ DMSO at 24 hpf for 48 h;B~D: embryo treated with 50，100，200 μmol·L-1 ADTM,respectively;E:ADTM significantly increased SIVs diameter in a concentration-dependent manner.#P<0.05 vs control group |
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| Fig 3 A:embryo treated with 0.1％ DMSO at 24 hpf for 48 h;B~D:embryo treated with 50，100，200 μmol·L-1 ADTM,respectively;E:ADTM slightly increased endothelial cells of zebrafish SIVs. Effects of ADTM on number of zebrafishSIVs endothelial cells(x±s,n=12) |
VRI诱导血管损伤转基因斑马鱼模型实验(Fig 4)发现，VRI处理后，ISVs和SIVs以及DLAVs都出现了明显的缺失。在不同浓度ADTM处理斑马鱼幼鱼48 h后，显示了明显的修复ISVs的效果，而且对SIVs区域也有一定程度上保护效果，并呈浓度依赖性(Fig 5)。
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| Fig 4 Schematic illustration of experimental plan on VRI induced vascular insufficiency in zebrafish |
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| Fig 5 Effects of ADTM on VRI induced vascular insufficiency in zebrafish(x±s,n=12) A:Embryo treated with 0.1％ DMSO at 48 hpf for 48 h;B: Embryo treated with 300 nmol·L-1 VRI at 48 hpf for 48 h;C~E:Embryo treated with 50，100，200 μmol·L-1 ADTM,respectively before VRI exposure;F:ADTM restored VRI-induced vascular insufficiency in zebrafish. #P< 0.05 vs control group;*P<0.05 vs VRI group |
为了更深入地了解ADTM在斑马鱼内的促进血管新生的分子机制，我们通过转录组学的技术分析经过ADTM处理后，斑马鱼体内的基因表达水平的变化。由于血管新生是一个全身性、整体性的机体调节的过程，所以我们研究斑马鱼整体的基因表达的变化。本研究中，模型组(VRI组)和药物处理组(VRI+ADTM)基因表达库中，每个库有核苷酸序列标签的总数量为4.6~6.8百万个。两个库中的核苷酸序列标签对应VEGA数据库，发现已有注释的 基因大约是2.1~3.2百万个(约占整体的46%)。
然后，我们通过DEGseq分析，得到两组之间基因表达差异有显著性(P<0.01)的有1 513个基因。KEGG pathway富集分析发现，胰岛素信号通路富集最为明显，19个明显变化的基因(P<0.01)富集在该通路，结果见Fig 6，上调基因：Cb1、CrkⅡ、GRF2、INSR、IRS、P13K、FOXO1、GSK-3β、FBP、PHK、PKA、LAR、SOS、MNK；下调基因：GK、PEPCK、GYS、PP1、S6。文献报道[12]，胰岛素激活IRSR、PI3K和GSK-3β等可引起胰岛素信号通路的活化，由此确定ADTM激活胰岛素信号通路。
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| Fig 6 Analysis of insulin signaling pathway in gene expression profile of ADTM and VRI treated zebrafish The insulin signaling pathway is overlaid with gene expression color criteria and ratios of gene expression from KEGG pathway: red triangle,significantly upregulated by ADTM(ADTM+VR vs VRI，P<0.01); blue triangle,significantly downregulated by ADTM(ADTM+VRI vs VRI，P<0.01); no triangle,not significantly changed or not detected. |
对挑选的4个关键基因(GSK-3β、BRAF、Sema3ab和IL1B)进行荧光定量PCR验证。实验结果表明(Tab 1)，4个基因的PCR结果变化趋势与转录组中获得的序列完全吻合，说明这4个基因确实在斑马鱼体内表达，并且斑马鱼转录组测序结果准确可靠。
| Gene symbol | Ref Seq. accession | Transcriptome(fold change) | P-value | qPCR(fold change) | P-value |
| GSK3β | NM_131381 | 1.58 | P<0.01 | 1.41±0.12 | P<0.05 |
| BRAF | NM_205744 | 1.67 | P<0.01 | 1.39±0.14 | P<0.05 |
| Sema3ab | NM_13106 | 2.00 | P<0.01 | 2.83±0.26 | P<0.05 |
| IL1B | NM_212844 | 0.15 | P<0.05 | 0.15±0.03 | P<0.05 |
血管创伤、缺血性心脏病、伤口愈合缓慢和闭塞性脉管炎等都是临床常见病，是影响人类健康的重要因素之一，而血管生长不足则是这些疾病共同的重要病理生理基础。因此，开展促血管新生作用的研究对诸多血管新生不足相关疾病的防治有着重要意义。我们先前建立的斑马鱼模型，用来评价药物对斑马鱼血管生成的作用效果，其中特定增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达在内皮细胞，允许实时观察血管系统体内动态变化的过程。斑马鱼凭借其独特的优势成为干预血管新生药物筛选的理想模型。VRI是一种可以抑制血管内皮生长因子受体1-2的化合物，在抗血管新生和抗癌方面有潜在的开发价值[13]。用VRI来模拟血管新生功能缺陷的模型，具有靶点清晰、针对性强等优势[8]。本研究以斑马鱼为模型，探讨丹参素衍生物对斑马鱼正常血管新生的干预作用，以及对VRI损伤血管的修复效果。研究发现，ADTM处理48 h后，明显增加正常斑马鱼的SIVs血管直径，对VRI诱导的血管损伤有明显的修复作用。以上结果表明，ADTM有促血管新生的作用。其次，转录组学研究表明，ADTM的促血管新生作用可能与胰岛素信号通路的激活有关。
转录组是特定细胞在某一功能状态下所能转录出的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA。转录组测序(RNA-Seq)是最近发展起来的利用深度测序技术进行转录分析的方法，这种技术已经改变了我们对真核转录认识的程度和复杂性，与其它技术相比，RNA-Seq能更准确地测量哺乳动物转录水平[14]。我们的研究结果表明，ADTM的促血管新生作用可能与胰岛素信号通路的调控有关。近几年胰岛素抵抗综合征的发病率和死亡率在不断增加，其中大部分是由于心血管疾病的影响而增加的风险[15]。文献报道表明，血管内皮细胞是胰岛素作用的重要细胞，胰岛素在维持血管内皮正常功能中起重要作用。对胰岛素耐受或血管内皮细胞功能紊乱进行治疗，可以降低心血管疾病的病变和死亡率[16]。因此，ADTM通过激活胰岛素信号通路，发挥促血管新生和血管修复的效果。
综上所述，ADTM对正常和血管损伤的斑马鱼模型，均有促血管新生的效果，其作用机制可能与胰岛素信号通路的激活有关。ADTM表现出心脏保护、神经保护和促血管新生的药理学作用，具有“脑心同治”的功效，其一药多种功能的作用机制及其多种功能间是否存在共同的药物靶点或信号通路，值得进一步研究和探索。
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中国科协主管,中国药理学会主办
文章信息
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文章历史
- 收稿日期: 2016-01-19