2. 药学部，重庆医科大学附属第一医院 重庆 400016
2. Dept of Pharmacology，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China
黏液分泌亢进是很多气道炎症性疾病如哮喘、囊性纤维化、变应性鼻炎、鼻-鼻窦炎的主要症状之一[1]。黏蛋白作为黏液的重要组成成分，是一种高度糖基化的大分子蛋白，分为膜结合型和分泌型，分泌型黏蛋白决定黏液的黏弹性，MUC5AC是人类气道上皮细胞中重要的分泌型黏蛋白，是气道黏液的主要成分之一。已有研究表明，MUC5AC在人鼻黏膜上皮细胞炎症模型中明显升高[2]。
胆碱能神经通路在鼻腔黏膜的高分泌中起了重要的作用[3] ，因此抗胆碱治疗在理论上应是鼻腔炎症的一种有效药物治疗。近年人们还意识到，在人体内存在着不依赖神经的胆碱能系统，这种非神经依赖性的胆碱系统失衡可导致疾病的发生[4]。苯环喹溴铵是一种新型的抗胆碱药，能够选择性阻断M3受体，对气道炎症具有较好的抑制作用[5, 6]。本课题组前期研究显示,苯环喹溴铵能有效抑制鼻炎大鼠鼻黏膜杯状细胞的黏液合成和黏蛋白MUC5AC的表达[7]，但大鼠和人有种属差异,因此,本实验旨在探明苯环喹溴铵对LPS诱导的人鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC5AC表达的影响，从而为鼻腔炎性高分泌性疾病治疗新药的开发应用提供理论基础和实验依据。
1 材料与方法 1.1 标本来源标本来源重庆医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科鼻腔扩容术和鼻中隔偏曲患者的钩突组织，患者无慢性鼻-鼻窦炎、无变态反应性疾病，取材近1月内无全身及局部使用糖皮质激素及其他抑制细胞生长的药物及手术外伤史。
1.2 药品与主要试剂胎牛血清、DMEM/F12(1 ∶1)培养基购于美国Gibco公司，表皮生长因子、内皮细胞生长因子、全反式维甲酸、转铁蛋白、鼠抗人单克隆抗体细胞角蛋白CK18、I型胶原酶、核酸染料Hoechst 33258、MTT、二甲基亚砜(DMSO)、脂多糖、苯环喹溴铵、鼠抗人MUC5AC单克隆抗体均购于美国Sigma公司，青链霉素双抗购于中国上海碧云天生物技术公司，Dylight 549标记的山羊抗小鼠IgG购于美国Abbkine公司，ELISA试剂盒购于中国上海西塘生物公司，ECL发光试剂盒购于美国Millipore公司，RNA提取试剂盒TRIzol、逆转录试剂盒、PCR引物均购于日本TaKaRa公司，胰岛素及两性霉素B由重庆医科大学附属第一医院药房提供。
1.3 鼻黏膜上皮细胞原代培养参照Wang等[8]的培养方法，做适当调整。将取下的钩突组织用含有青霉素(1×105 IU·L-1)和链霉素(100 g·L-1)的生理盐水反复冲洗5次，去除黏液、血液、坏死物及黏膜下组织。将组织剪碎成1 mm3大小，质量浓度为1 g·L-1 Ⅰ型胶原酶37 ℃消化1 h，筛网过滤去除未消化的组织块。4℃ 1 000 r·min-1离心5 min后弃上清，加入含有15%的胎牛血清、青霉素(1×105 IU·L-1)和链霉素(100 g·L-1)的DMEM/F-12(1 ∶1)培养基制成细胞悬液。差速贴壁1 h去除成纤维细胞。台盼蓝染色，细胞活性大于90%，接种于6孔板，置5% CO2的孵箱中培养。24 h后更换为含1×105 IU·L-1青霉素、100 g·L-1链霉素、2.5 mg·L-1两性霉素B、20 μg·L-1表皮生长因子、4 mg·L-1内皮细胞生长因子、100 μg·L-1维生素A酸、5 mg·L-1转铁蛋白、40 IU·L-1胰岛素的无血清培养基，隔天换液1次。培养1周左右，细胞接近汇合时进行传代，用第2代细胞进行下一步实验。
1.4 免疫荧光鉴定培养细胞接近汇合时去培养基，PBS洗2次，每次3 min；经4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗2次，每次3 min；体积分数0.002 Triton X-100穿透20 min，PBS洗2次，每次3 min；体积分数为0.05的牛血清白蛋白封闭60 min；加入鼠抗人角蛋白CK18单克隆抗体4 ℃孵育过夜，PBS洗2次，每次3 min；Dylight 549标记的山羊抗小鼠IgG，避光室温孵育2 h，PBS洗2次，每次3 min；Hoechst 33258避光室温核染5 min，PBS洗2次，每次3 min；荧光显微镜下观察染色情况。以PBS代替一抗作阴性对照。
1.5 MTT法检测BCQB对鼻黏膜上皮细胞活性的影响按照文献介绍的方法做必要调整[9]。细胞近汇合时制备1×105·L-1的含血清细胞悬液，每孔加入100 μL的细胞悬液接种于96孔板中，培养24 h待细胞贴壁后吸出上清液，加入100 μL含不同浓度BCQB的无血清培养基，并将其分为对照组(常规无血清培养)和实验组(分别加入含10-8、10-7、10-6、10-5、10-4 mol·L-1 BCQB的培养基)，每组设置5个复孔。无血清培养24 h后，每孔加入5 g·L-1 MTT 10 μL，继续培养4 h后，吸出培养液及MTT，每孔加入DMSO 150 μL，脱色摇床室温振荡10 min，酶标仪检测490 nm处的吸光度(A，abstract)值。以上实验重复3次，计算各实验组抑制率/%=(1-A实验组/A对照组)×100%。为使药物安全有效，本课题选择使细胞抑制率＜10%(即存活率＞90%)的药物浓度进行后续实验。
1.6 实验分组及处理将培养的鼻黏膜上皮细胞分成对照组、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)组、BCQB低剂量组、BCQB中剂量组、BCQB高剂量组和异丙托溴铵组(IB组)(阳性对照组)。对照组加入无血清培养基；LPS组加入含LPS(1 mg·L-1)的无血清培养基；BCQB低剂量组、中剂量组和高剂量组先加入含BCQB(浓度分别为10-8、10-7、10-6 mol·L-1)的无血清培养基孵育30 min后，再加入LPS(1 mg·L-1)；IB组先加入含IB(10-6 mol·L-1)的无血清培养基孵育30 min后，再加入LPS(1 mg·L-1)。干预后各组放5% CO2培养24 h。
1.7 Real-timePCR检测MUC5AC mRNA表达 收集细胞分别提取总RNA，用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，采用CFX96荧光定量PCR仪检测MUC5AC mRNA的表达。MUC5AC上游引物5′-TACCAGTGCCAGTGTGTGTGC-3′，下游引物5′-GCCATACACGGGCACAATCT-3′，扩增片段大小为126 bp；GAPDH上游引物5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′，下游引物5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′，扩增片段大小为132 bp。反应体系为：模板1 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，SYBR荧光酶5 μL，DEPC水3.2 μL，共10 μL。反应条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，共40个循环。反应结束，软件自动分析出MUC5AC mRNA的相对表达量。
1.8 Westernblot检测MUC5AC蛋白表达 收集已处理好的各组细胞，提取总蛋白，分别进行蛋白浓度测定，蛋白变性处理。取40 μg待测蛋白样品行SDS-PAGE电泳(90 V 2 h)，电泳转至PVDF膜后，5% BSA封闭2 h后，加入一抗(1 ∶100)，4 ℃过夜；加入二抗(1 ∶3 000，)常温1 h；显色、曝光、Quantity One软件进行图像分析。
1.9 ELISA法检测MUC5AC蛋白表达收集各组上清液，2 000 r·min-1，离心15 min，采用双抗夹心法定量检测上清液中黏蛋白MUC5AC的表达量，严格按照说明书步骤进行操作。ELISA试剂盒购自上海西塘生物科技有限公司，检测灵敏度为300 μg·L-1，用全自动酶标仪检测标准品和样品在450 nm处吸光值(A)。根据标准曲线将A值换算成浓度值。
1.10 统计学分析采用SPSS 18.0对数据进行统计学分析，实验数据采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。
2 结果 2.1 鼻黏膜上皮细胞原代培养情况细胞悬液接种后于倒置显微镜下观察，细胞呈圆形，折光性强，分散呈单个悬浮于培养基中，未见明显纤毛运动。培养24 h后，大部分细胞已贴壁生长，部分呈圆形，部分呈多角形。3～4 d后细胞聚集成短梭形，多个小集落生长。6～7 d后细胞集落进一步增大、增多，逐渐汇合成“铺路石”状，未见明显纤毛摆动。
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| Fig 1 Primary culture of human nasal epithelial cells(×200) A: Cells after 24 hours；B: Cells after 3～4 days；C: Cells after 6～7 days |
经免疫荧光染色细胞角蛋白18(cytokeratin antibody18，CK 18)阳性，呈红色荧光，证实为上皮源性细胞(Fig 2)。
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| Fig 2 A：Hoechst33258；B：CK18；C：Merge Immunofluorescence staining for expression of CK 18 in HNECs(×200) |
不同浓度的BCQB作用于鼻黏膜上皮细胞24 h后能不同程度抑制细胞活性，其抑制作用随药物浓度增加而不断加强。当BCQB浓度在10-6,10-7,10-8 mol·L-1时，抑制率在10%以下(即细胞存活率＞90%)，即药物浓度安全，因此本研究选择10-6、10-7、10-8 mol·L-1作为高、中、低剂量用于后续实验(Fig 3)。
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| Fig 3 The inhibition effect of BCQB on HNECs(%) |
PCR检测MUC5AC mRNA表达 Real-time PCR结果显示，LPS组MUC5AC mRNA表达量明显高于对照组(P＜0.01)，表明LPS能够成功诱导鼻黏膜上皮MUC5AC mRNA表达； BCQB低剂量组MUC5AC mRNA低于LPS组(P＜0.05)，高于对照组(P＜0.01)，表明低剂量组能够降低LPS诱导的MUC5AC，但不能完全使其恢复正常；BCQB中剂量组表达低于LPS组(P＜0.01)，但高于对照组(P＜0.01)，表明中剂量组能够降低LPS诱导的MUC5AC，但不能完全使其恢复正常；高剂量组和IB组的表达均低于LPS组(P＜0.01)，与对照组相比差异不明显(P＞0.05)，表明高剂量组能够降低LPS诱导的MUC5AC，并使其基本恢复正常水平(Fig 4)。
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| Fig 4 MUC5AC mRNA expression in HNECs **P＜0.01 vs C; #P＜0.05,##P＜0.01 vs LPS |
blot检测MUC5AC蛋白表达 结果显示，LPS组MUC5AC蛋白表达量明显高于对照组(P＜0.01)，表明LPS能够成功诱导鼻黏膜上皮MUC5AC蛋白表达。苯环喹溴铵中、低剂量组均低于LPS组(P＜0.01)，但高于对照组(P＜0.01)，表明中、低剂量组能够降低LPS诱导的MUC5AC，但不能完全使其恢复正常；高剂量组和IB组的表达均低于LPS组(P＜0.01)，与对照组相比差异不明显(P＞0.05)，表明高剂量组能够降低LPS诱导的MUC5AC，并使其基本恢复正常水平(Fig 5,Fig 6)。
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| Fig 5 MUC5AC protein expression in HNECs detected by Western blot 1：C；2：LPS；3：BCQBL；4：BCQBM；5：BCQBH；6：IB |
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| Fig 6 The protein expression of MUC5AC in HNECs detected by Western blot **P＜0.01 vs C；##P＜0.01 vs LPS |
LPS组上清液中MUC5AC蛋白表达量明显高于对照组(P＜0.01)，表明LPS能够成功诱导鼻黏膜上皮MUC5AC蛋白表达。苯环喹溴铵高、中、低剂量组及异丙托溴铵组均低于LPS组(P＜0.01)，与对照组水平相当(P＞0.05)，苯环喹溴铵高、中、低剂量组及异丙托溴铵组MUC5AC表达水平接近，差异无显著性(P＞0.05)，表明BCQB各剂量组对LPS诱导的鼻黏膜上皮高表达MUC5AC治疗有效，且各剂量组均能使MUC5AC基本恢复正常(Fig 7)。
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| Fig 7 The protein expression of MUC5AC in supernatant detected by ELISA(μg·L-1) **P＜0.01 vs C；##P＜0.01 vs LPS |
在气道炎症性疾病过程中，黏蛋白基因表达上调,分泌细胞增生肥大,产生大量黏蛋白,是气道高分泌的首要现象[10]。黏蛋白是气道黏液的主要分子组成，在已知的20多种人类黏蛋白基因中，MUC5AC被认为是鼻黏膜上皮细胞表达的主要黏蛋白基因[11]。因此,本研究选定MUC5AC 为炎性高分泌调控的靶蛋白。脂多糖是革兰阴性杆菌细胞壁的重要组成部分，可引起呼吸道上皮损伤，常被用来制作各种炎症模型[12, 13]。Rhee等[14]的研究中LPS可成功诱导大鼠气道高表达MUC5AC，Kim等[15]的研究发现，LPS能够诱导鼻窦炎大鼠模型的鼻黏膜MUC5AC基因表达升高，Wang等[2]的研究表明LPS能够使体外培养的正常人鼻黏膜上皮细胞高表达MUC5AC。因此，本研究选择LPS作为诱导剂，实验结果成功诱导了体外培养的人鼻黏膜上皮细胞高表达MUC5AC，证明其可用于后续实验。
Cortijo等[16]的研究发现,M受体拮抗药阿地溴铵能够减少人支气管和培养的呼吸道上皮细胞中MUC5AC 表达水平，抑制杯状细胞增生。Bos 等[17]的研究也发现,M 受体拮抗药噻托溴铵不仅能抑制过敏原诱导的黏液腺增生、嗜酸粒细胞浸润，还能降低杯状细胞黏蛋白基因MUC5AC 表达水平。提示，M 受体拮抗剂能下调气道黏蛋白基因的表达，从而缓解气道的炎性高分泌现象。目前，世界各国耳鼻咽喉科专家一致承认“同一气道同一疾病”(one airway one disease)的观点[18]，认为上、下气道在组织结构上是连续的，上、下气道的疾病是密切相关的。因此，M 受体拮抗剂可能通过下调气道MUC5AC 的表达来发挥对鼻炎鼻分泌亢进的缓解作用。
苯环喹溴铵是我国自主研发的选择性M3胆碱受体拮抗药，已获得中国专利，目前该药的三期临床试验已经基本完成，有望获得批准治疗各型鼻炎、哮喘等分泌亢进的疾病。本课题组前期研究提示苯环喹溴铵能够缓解大鼠变应性鼻炎症状，减少鼻黏膜黏蛋白MUC5AC的表达[7]。本研究中，我们在体外研究了苯环喹溴铵对LPS诱导的鼻黏膜上皮细胞分泌MUC5AC的影响。从荧光定量PCR检测结果可以看出，苯环喹溴铵各剂量组MUC5AC mRNA的表达均较LPS组明显降低，提示BCQB能够从核酸水平对LPS诱导的人鼻黏膜上皮细胞MUC5AC的表达产生抑制作用。从Western blot和ELISA检测结果中我们观察到，苯环喹溴铵高、中、低剂量组MUC5AC蛋白表达与LPS组相比均明显下降。这表明，苯环喹溴铵能够从蛋白水平抑制LPS诱导的人鼻黏膜上皮细胞表达MUC5AC。结合PCR、Western blot和ELISA 结果,我们从体外实验证明BCQB对于鼻黏膜上皮细胞高分泌MUC5AC具有抑制作用。
综上所述，本研究提示苯环喹溴铵能够抑制LPS诱导的人鼻黏膜上皮细胞MUC5AC的表达，这与我们前期的在体动物实验研究结果一致，进一步说明BCQB能有效抑制鼻炎状态下鼻黏膜MUC5AC的表达，但其在体外具体的作用机制，通过何种细胞内外通路起作用的，有待进一步研究阐明。
( 致谢: 本实验完成于重庆医科大学附属第一医院实验研究中心。实验过程中的标本采集得到重庆医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科柯霞老师、杨玉成老师等的帮助，实验中所涉及的技术方法得到实验研究中心汤为学老师、陈力学老师及邓晓娟老师的帮助，在此深表感谢！ )
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