2. 中大南药发展有限公司, 广东 梅州 514000
2. Zhongda Medical Development Co.ltd, Meizhou Guangdong 514000, China
紫杉醇抗肿瘤活性强，使用历史悠久，但口服生物利用度低。临床上现有使用紫杉醇注射液，但因其处方含有聚氧乙烯基蓖麻油(cremophor EL)和乙醇，使用时容易发生严重的过敏反应，需要比较严密的监护，不便于患者使用。目前对于紫杉醇的研究多针对于口服制剂，开发新剂型如紫杉醇脂质体、纳米紫杉醇、聚合物胶束剂型、环糊精(CD)包合物等以提高其生物利用度[1, 2, 3]。
紫杉醇主要来源于红豆杉树皮、枝叶等。红豆杉枝叶提取物包含大量的紫杉烷类单体，如紫杉醇、三尖杉宁碱、10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ(10-DAB)、10-去乙酰基紫杉醇(10-DAT)等。本课题组前期研究发现，口服红豆杉枝叶提取物后，其抗肿瘤活性远高于口服紫杉醇单体[4]。基于此，对红豆杉枝叶提取物以及其中主要的紫杉烷类成分(紫杉醇、三尖杉宁碱与10-DAB)的抗肿瘤活性进行研究，考察其对四株肿瘤细胞(非小细胞肺癌A549细胞、乳腺癌MDA-MB-231与MCF-7细胞、卵巢癌A2780细胞)的毒性，以指导新型口服含紫杉醇抗肿瘤药物的开发。
1 材料与方法 1.1 细胞与试剂A549、MDA-MB-231、MCF-7、A2780四株细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源库。培养基DMEM (Dulbecco modified Eagle medium)与RPMI 1640购自美国 Hyclone 公司；胎牛血清(FBS)、双抗(青霉素-链霉素混合溶液)购自美国Gibco 公司；MTT、DMSO (Dimethyl Sulphoxide)购自美国 MP 公司；紫杉醇(PTX)、三尖杉宁碱(CEP)、10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ(10-DAB)购自上海融禾医药科技发展有限公司；红豆杉枝叶提取物由中山大学药学院天然药物化学研究所提供，提取方法详见本课题组已发表文章[5]。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养与接种A549、A2780细胞培养于含10%胎牛血清、0.1%双抗(100 μmol·L-1青霉素及100 mg·L-1链霉素)DMEM/高糖培养基中，MDA-MB-231、MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清、0.1%双抗(100 μmol·L-1青霉素及100 mg·L-1链霉素)RPMI 1640培养基中，所有细胞于5% CO2、37°C条件下培养。细胞复苏，传代3次后开始接种细胞于96孔板。
1.2.2 药物处理[6, 7]细胞接种24h后给予药物处理。红豆杉提取物药物孵育浓度为0、0.1×103、0.25×103、0.5×103、1.0×103、5.0×103、1.0×104、5.0×104 μg·L-1；紫杉醇药物孵育浓度为0、0.9、2.7、8.4、25.6、76.9、0.3×103、0.9×103 μg·L-1；三尖杉宁碱药物孵育浓度为0、0.4×103、0.8×103、4.1×103、8.3×103、4.2×104、8.3×104、1.7×105 μg·L-1，10-DAB药物孵育浓度为0、0.3×103、0.5×103、2.7×103、5.4×103、2.7×104、5.4×104、1.1×105 μg·L-1。给药时间均为72h。所有被试物均溶于DMSO中，每个浓度点设5个复孔。
1.2.3 MTT检测药物处理结束后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1，溶于PBS)，在细胞孵育箱中继续孵育4h，吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，室温下于振荡器上振荡10 min，除去气泡，用多功能酶标仪在570 nm处测定吸光度值(A)，按下式计算细胞存活率(cell survival rate)。
细胞存活率/%=(实验孔吸光度-空白对照孔吸光度)/(溶剂对照孔吸光度-空白对照孔吸光度)×100%
2 结果 2.1 红豆杉提取物对四种肿瘤细胞的毒性MTT结果显示，红豆杉提取物在四株细胞上均表现出明显的抗肿瘤活性。对于4株肿瘤细胞，在低剂量范围内红豆杉提取物的抗肿瘤活性表现出明显的量效关系。在一定的剂量范围内(低剂量)增大给药浓度，可明显的提高红豆杉提取物的抗肿瘤活性。
2.2 紫杉醇对4种肿瘤细胞的毒性浓度为0~8.5×102 μg·L-1的紫杉醇孵育，明显地抑制了4株细胞的增殖，细胞存活率下降。对MCF-7细胞，在所设浓度范围内具有明显的剂量依赖性。其余细胞上的结果显示，在低浓度区域内紫杉醇对肿瘤细胞增殖的抑制作用具有剂量依赖性，在高于25.6 μg·L-1浓度时，继续增大给药浓度并不能明显的增强紫杉醇对细胞的增殖抑制作用。
2.3 三尖杉宁碱对4种肿瘤细胞的毒性在4株细胞上，三尖杉宁碱均表现出明显的细胞毒性。用浓度为41.6 μg·L-1的三尖杉宁碱孵育细胞，细胞的存活率已下降50%左右。其中MDA-MB-231与A2780两株细胞对三尖杉宁碱的敏感性更为明显。在浓度为0.8×103~4.2×104 μg·L-1范围内，三尖杉宁碱对4株肿瘤细胞增殖活性的抑制出现一不同程度的平台期，即在此浓度范围内，随着三尖杉宁碱浓度的增大，对肿瘤细胞增殖抑制率几乎不变。而当三尖杉宁碱的给药浓度高于4.2×104 μg·L-1时，其细胞毒性又呈现剂量依赖性。
2.4 10-DAB对4种肿瘤细胞的毒性10-DAB对4株肿瘤细胞增殖抑制作用表现不尽相同。其中，10-DAB对A549、MDA-MB-231与A2780三株细胞的细胞毒性趋势较为接近。低于2.7×104 μg·L-1的10-DAB孵育细胞，其细胞毒性呈现明显的剂量依赖性；而当10-DAB浓度高于2.7×104 μg·L-1时，其对肿瘤细胞增殖抑制作用几乎不再随浓度改变。较为特别的是MCF-7细胞，10-DAB对MCF-7细胞的毒性在0~1.1×105 μg·L-1的浓度范围内呈现明显的剂量依赖性，随着10-DAB浓度的增加，MCF-7细胞的存活率不断下降。
3 讨论紫杉醇是从红豆杉中分离出来的一种高效的抗肿瘤药物，在临床上被广泛用作治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤。目前临床上现有使用紫杉醇注射液，使用时常产生急性过敏等不良反应。但紫杉醇口服吸收生物利用度很低，迄今尚无紫杉醇的口服制剂上市。因此，开发含紫杉醇口服抗肿瘤药物备受关注。
本课题组对红豆杉枝叶提取物进行研究。前期研究发现，红豆杉枝叶提取物具有明显的抗肿瘤活性，对人非小细胞肺癌A549细胞增殖有明显的抑制作用。在人非小细胞肺癌A549细胞裸鼠移植瘤抑制实验中，红豆杉提取物对肿瘤的抑制率是单用紫杉醇的2倍[4]。基于此，本课题组拟将红豆杉嫁接优株提取物开发为口服含紫杉醇抗肿瘤制剂。红豆杉枝叶提取物中含多种紫杉烷类成分，其中紫杉醇、三尖杉宁碱、10-DAB是其中主要的紫杉烷类成分。本研究考察红豆杉提取物、紫杉醇、三尖杉宁碱、10-DAB在4株细胞上的细胞毒性，以期解释红豆杉提取物的强抗肿瘤活性，为后期开发口服含紫杉醇抗肿瘤药物提供依据与指导。
前两部分关于红豆杉提取物与紫杉醇的细胞毒性研究显示，在同样紫杉醇剂量下，红豆杉提取物(紫杉醇含量约为2%)的抗肿瘤细胞增殖活性远远高于紫杉醇。目前检测的三种紫杉烷类成分，其抗肿瘤活性强度最高的是紫杉醇，最低的是10-DAB。红豆杉提取物、紫杉醇、三尖杉宁碱、10-DAB对不同细胞的细胞毒性趋势一致，4株细胞对其毒性敏感性依次为MDA-MB-231、A2780、A549、MCF-7。
本研究阐明了红豆杉提取物及其三种主要的紫杉烷类成分对4株细胞的毒性，部分解释了红豆杉提取物具有强抗肿瘤活性的原因，指导红豆杉提取物提取工艺的改进，为红豆杉提取物开发新型含紫杉醇抗肿瘤药物提供实验依据。
(致谢：本实验在中山大学药学院临床药理研究所完成，感谢各位老师与同学的支持与帮助！)
| [1] | Liu L, Chang S F, Sun J C, et al. Ultrasound-mediated destruction of paclitaxel and oxygen loaded lipid microbubbles for combination therapy in ovarian cancer xenografts[J]. Cancer Lett, 2015, 361(1): 147-54. |
| [2] | Jiang L, Li L, He X D, et al. Overcoming drug-resistant lung cancer by paclitaxel loaded dual-functional liposomes with mitochondria targeting and pH-response[J]. Biomaterials, 2015(52): 126-39. |
| [3] | 何伍, 刘洋. 紫杉醇新剂型及研究进展[J]. 世界临床药物, 2009, 30(5): 297-300. He W, Liu Y. Progress of clinical research and new formulations of paclitaxel[J]. World Clin Drugs, 2009, 30(5): 297-300. |
| [4] | 刘斌. 红豆杉枝叶提取物抗肿瘤活性及相关作用机制研究[D]. 中山大学, 2015: 1-00. Liu B. The antitumor activity of extract derived from the branches and leaves of Taxus yunnanensis and the mechanisms involved[D]. Sun Yat-sen University, 2015: 1-100. |
| [5] | Liu B, Gou X L, Bai X P, et al. Simultaneous determination of seven taxoids in rat plasma by UPLC-MS/MS and pharmacokinetic study after oral administration of Taxus yunnanensis extracts[J]. J Pharm Biomed Anal, 2015(107): 346-54. |
| [6] | 刘同祥, 张艳平, 徐羽, 等. 紫杉醇联合三尖杉宁碱诱导人肝癌HepG2细胞凋亡[J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(9): 115-22. Liu T X, Zhang Y P, Xun Y, et al. Effect of taxol combining with cephalomannine on apoptosis of liver cancer cell HepG2[J]. Chin J Exp Tradit Med Formul, 2010, 16(9): 115-22. |
| [7] | 原少斐, 朱林佳, 郑维锷, 等. 黄芩素联合紫杉醇对人肺癌细胞的生长抑制作用[J]. 中国现代应用药学, 2013, 30(12): 1306-10. Yuan S F, Zhu L J, Zheng W E, et al. Effect of Baicalein Combined Paclitaxel on Proliferation of human lung carcinoma cell[J]. Chin J Mod Appl Pharm, 2013, 30(12): 1306-10. |