2. 福建医科大学 老年健康研究院, 福建 福州 350001;
3. 福建医科大学 药学院, 福建 福州 350001
2. Elderly Health Research Institute, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China;
3. Fujian Medical University College of Pharmacy, Fuzhou 350001, China
糖尿病是心血管疾病的致病因素之一[1]。细胞不可逆的生长停滞的状态为衰老，糖尿病主要特征是高血糖，高糖可以诱导内皮细胞衰老[2]。动脉粥样硬化斑块处内皮细胞与非斑块处的内皮细胞相比，呈现出衰老细胞的特征，血管内皮细胞在衰老过程中，分泌的各种生物活性因子也在发生变化，如内皮依赖性血管舒张因子合成下降、炎性因子合成增加、黏附因子表达增多等[3]。细胞的老化加快动脉粥样硬化的进程[4]。
PTEN(phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten)是具有脂质和蛋白双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，去磷酸化PIP3，生成PIP2，负调节PI3K-AKT信号通路[5]。高糖抑制PI3K-AKT信号通路诱导内皮细胞凋亡是PTEN依赖性[6]。过氧钒(PIC)是蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制剂，低剂量就可以和PTEN酶结合，抑制其活性[7]。PI3K-AKT信号通路与细胞周期的调控有关，抑制PI3K-AKT使细胞处于G1期，诱导纤维细胞衰老[8]。因此，研究PTEN抑制剂对高糖诱导内皮细胞衰老相关细胞衰老的影响，为糖尿病血管并发症提供治疗的新思路。
1 材料与方法 1.1 材料内皮细胞专用培养基购自Sciencecell ；0.025 g·L-1胰酶，胶原酶Ⅰ购自GIBCO；CCK8，β-半乳糖苷酶(β-gal)试剂盒购自碧云天；Annexin-V-FLUOS 染色试剂盒购自Roche公司；RNAprep Pure总RNA提取试剂盒试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；逆转录试剂盒购自Promega 公司，SYBR Premix Ex Taq 定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；BCA蛋白定量试剂盒，HRP化学发光检测试剂盒购自武汉博士德公司；PTEN、 p16 抗体购自CST公司；过氧钒(PIC)购自Merck公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养取当天剖腹产新鲜脐带10~15 cm，0.01 g·L-1胶原酶Ι消化内皮细胞，37℃消化15 min。收集所有消化液，1000 r·min-1离心 15 min，弃上清，加入 4 mL培养液悬浮细胞，接种到塑料培养瓶中。细胞生长融合达80%~90%，胰酶消化细胞，取2~6代细胞做实验。
1.2.2 原代内皮细胞签定FⅧ因子免疫组织化学染色鉴定内皮细胞。
1.2.3 实验分组实验分为正常组、实验组、PIC处理组，正常组糖浓度为5.6 mmol·L-1 (C组)，实验组糖浓度为30 mmol·L-1 (HG)，PIC处理组的PIC浓度分别为1、10、100、1000 nmol·L-1 (PIC)，PIC预培养0.5 h后加入高糖，各组作用时间为2、4、6 d，实验重复5次。选取合适的高糖处理时间和PIC处理浓度。
1.2.4 CCK8检测细胞生存率96孔板每孔加入100 μL 105个细胞，按照实验需要进行培养，实验结果后每孔加入10 μL CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1 h，450 nm测定吸光度。
1.2.5 β-半乳糖苷酶染色试剂盒(SA-β-Gal)测定细胞衰老衰老细胞在pH 6.0时有高β-半乳糖苷酶活性，以X-Gal为底物催化下会生成深蓝色产物。显微镜下可以看到蓝色的表达β-半乳糖苷酶的阳性细胞。6孔板培养的细胞，按实验分组处理细胞后，室温固定15 min，每孔加入1 mL染色工作液，37℃孵育6 h，显微镜下观察。计数阳性细胞数。
1.2.6 FITC- PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率参照Annexin-V-FLUOS 染色试剂盒说明书操作：细胞分组干预后，用胰酶(0.25%，不含EDTA)消化处理细胞，1000 r·min-1离心5 min,收集细胞沉淀，PBS清洗2遍后，加入500 μL FITC/PI试剂盒缓冲液重悬细胞，取300 μL悬液于流式管中，分别加入FITC 3 μL、PI 3 μL，避光15 min后上机检测。
1.2.7 实时荧光定量PCR测定RNAprep Pure总RNA提取试剂盒，电泳结果显示出清晰的28 S和18 S两条带，且28 S＞18 S，Rromega逆转录试剂盒获得cDNA产物(按Rromega公司反转录试剂盒说明书进行)，SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应在LightCycle荧光PCR仪上测定,引物分别是：目标基因p16 5′-CCCCACTACCGTAAATGTCCA-3′;5′-TG CTCACTCCAGAAAACTCCAA-3′目标基因PTEN5′-TCAGGCGAGGGAGATGAGA-3′,5′-GACGAAGAGGA GGCGAGAAA-3′ PTEN 目标基因P21 5′-TCAAAT CGTCCAGCGACCTTC-3′;5′-CATGCCCTGTCCATAG CCTCTAC-3′内参基因(GAPDH)的扩增效率一致，不同试验组内参基因GAPDH相差1~2个循环，利用2-△△CT方法进行相对定量。
1.2.8 Western blot检测总PTENp16蛋白水平：收集细胞，裂解液裂解，4℃，12 000 r·min-1离心10 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度，上样缓冲液稀释各样品蛋白，95℃变性5 min后上样。先后经电泳、转膜、封闭过夜后，分别加入PTEN、p16一抗4℃振荡过夜，TBST洗5 min×3次，加入HRP标记的二抗常温孵育1 h，ECL法显影，应用凝胶成像分析仪测定蛋白条带灰度后，计算各蛋白条带和内参照β-actin 的比值。
1.3 统计学处理 数据以
± s表示，采用SPSS 11.5软件分析，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。
原代内皮细胞培养3 h后开始贴壁，24 h完全贴壁，早期贴壁细胞呈短梭形，细胞多成团生长，少数细胞分散生长；2~3 d后细胞单层铺满呈铺路石样生长(Fig 1)。内皮细胞FⅧ抗原相关染色鉴定，FⅧ是由因子FⅧ促凝成分(FⅧ∶C)和内皮细胞合成的vWF(von Willebrand factor)组成的一种复合物，FⅧ抗原阳性细胞表现为胞质中可见染成棕褐色的颗粒，取3~5代的细胞做实验。Fig 1A原代培养HUVECs细胞形态(×200);Fig 1B细胞免疫化学染色法鉴定HUVECs(×400)，胞质中出现棕褐色颗粒细胞为FⅧ抗原阳性表达细胞。
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| Fig 1 Cultivation and identification of endothelial cells A:Morphology of HUVEC(×100)；B:Identification of HUVEC by FⅧ immunochemical staining |
Fig 2A： HG组不同时间点高糖对内皮细胞生存率的影响，以C为对照组，30 mmol·L-1高糖降低内皮细胞生存率,并随时间延长降低，作用2、4、6 d生存率分别为86.5%±3.5%、73.5%±5.1%、65.4%±4.6%(P < 0.01，n=5)；Fig 2B:PIC 对内皮细胞生存率的影响，与C组相比，1000 nmol·L-1PIC降低内皮细胞生存率，生存率为76.2%±3.7% (P < 0.01，n=5)，其它浓度PIC对内皮细胞生存率没的影响；Fig 2C: 以C对照组，不同浓度 PIC 预培养0.5 h后，30 mmol·L-1高糖作用4 d对细胞生存率的影响，与高糖作用组相比，10、100 nmol·L-1PIC可以增加高糖作用内皮细胞的生存率(P < 0.01，n=5)。
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| Fig 2 Influence of different experimental groupon endothelail cell survival rate A:Different time of high glucose on endothelial cell survival rate; B:Influence of different concentration of PIC on endothelial cell survival rate; C: Influence of different concentration of PIC on high glucose induced endothelial cell survival rate. **P < 0.05 vs HG |
根据CCK8结果实验分为以C组、高糖处理组(HG)、PIC 10 nmol·L-1+高糖处理组、PIC 100 nmol·L-1+高糖处理组，作用时间为6 d。流式结果显示C、HG、PIC 10 nmol·L-1+高糖处理组、PIC 100 nmol·L-1+高糖处理组凋亡率分别为(10.2±1.06)%、(28.64±1.83)%、(16.40±1.86)%、(15.40±1.16)%，高糖作用内皮细胞6 d，细胞的凋亡率增加，PIC 10 nmol·L-1+高糖处理组、PIC 100 nmol·L-1+高糖处理组降低高糖诱导的细胞凋亡。与C组相比，HG组P < 0.01；PIC组与HG相比，P < 0.01；PIC 10 nmol·L-1+高糖处理组、PIC 100 nmol·L-1+高糖处理组相比差异没有显著性，n=3。如Fig 3所示。
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| Fig 3 Influence of PTEN inhibitors on high glucose induced endothelail cell apoptosis **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs HG |
实验分为C组、高糖处理组(HG)、PIC 10 nmol·L-1+高糖组、PIC 100 nmol·L-1+高糖组，作用时间为4 d。 A图显示SA-β-Gal染色：衰老细胞表达绿色阳性细胞，HG组较C组SA-β-Gal的阳性细胞数增加，PIC 10 nmol·L-1+高糖组、PIC 100 nmol·L-1+高糖组较HG组SA-β-Gal的阳性细胞数降低。B图显示定量PCR结果： HG组较C组p16 mRNA表达增加(3.3±0.6)倍，PIC 10 nmol·L-1+高糖组、PIC 100 nmol·L-1+高糖组较HG组p16mRNA分别降为(2.3±0.6)、(2.1±0.4)倍。C图显示Western-blot蛋白灰度扫描结果：HG组较C组p16蛋白表达增加(2.7±0.4)倍，PIC 10 nmol·L-1+高糖组、PIC 100 nmol·L-1+高糖组较HG组p16蛋白表达分别降为(1.7±0.2)、(1.6±0.6)。如Fig 4所示。
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| Fig 4 Influence of PTEN inhibitors on high glucose induced endothelail cell senescence A:The influence of PTEN inhibitors on high glucose induced endothelial cell senescence by SA-β-gal l staining; B:The influence of PTEN inhibitors on high glucose induced endothelial cell p16rnRNA expression; C:The influence of PTEN inhibitors on high glucose induced endothelial cell p16 protein expression. *P < 0.05 vs HG |
对照组(C)、高糖组(HG)72 h，定量PCR结果显示HG组较C组PTENmRNA增加(2.7±0.6)倍；Western blot结果显示蛋白灰度PTEN/Actin比较，HG组较C组PTEN蛋白表达增加1.81±0.23。如Fig 5所示。
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| Fig 5 Influence of high glucose induced endothelial PTENmRNA and protein expression *P < 0.05 vs control |
细胞周期可分为G1、S、G2，M 4个时期，细胞周期停滞是细胞衰老的一个关键特征，研究发现衰老细胞主要含有G1期的DNA，衰老细胞停滞于G1期，不能顺利进人S期，细胞不可逆的生长停滞。p16基因是一种抑癌基因，在细胞周期的G1期调控中起重要作用，p16蛋白抑制细胞周期。G1-S期的转化受Rb-p16-cdk4/6调控[9]。研究发现,细胞衰老时,p16 表达明显增高; 当细胞中导入p16 基因可出现衰老表型，因此p16 是细胞寿限的关键调控基因[10]。细胞衰老时乳糖苷酶活性增加，SA-β-Gal染色呈绿色阳性。实验结果发现与正常组相比，高糖(30 mmol·L-1)作用内皮细胞4 d，表达SA-β-Gal绿色阳性细胞增加，p16mRNA 及蛋白表达增加，因此高糖作用内皮细胞4 d可以诱导内皮细胞衰老。
细胞衰老影响细胞膜完整性，细胞内生成的自由基、不完全氧化产生的自由基攻击细胞膜上的胆固醇和不饱和脂肪酸。产生的有毒分子导致细胞凋亡和细胞死亡。实验结果显示，高糖(30 mmol·L-1)作用内皮细胞4 d内皮细胞老化，作用6 d后细胞凋亡增加，存活率明显下降。
研究表明高糖通过上调PTEN诱导内皮细胞凋亡[11]，实验结果高糖作用内皮细胞4 d PTEN mRNA 及蛋白表达增加2倍以上，PTEN具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性，负调节PI3K-AKT信号通路，参与调控细胞多种功能如细胞周期进展，细胞迁移、扩散和生长[12]。PIC是PTEN的抑制剂，蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制剂，较小的剂量就可以抑制PTEN，调节PI3K-AKT信号通路。PTEN抑制对损伤的神经元具有保护作用[13]，PTEN抑制剂能缓解内毒素诱导的急性肺损伤[14]。CCK8结果显示，单独0.1~100 nmol·L-1PIC作用低糖培养的内皮细胞，0.1~100 nmol·L-1PIC内皮细胞的生存率略增加，1000 nmol·L-1PIC对细胞生长具有抑制作用；高糖(30 mmol·L-1)培养内皮细胞4 d可以抑制细胞生存率，0.1 nmol·L-1PIC预培养不能改善高糖作用的内皮细胞生存率，10、100 nmol·L-1预培养增加高糖作用的内皮细胞生存率，100 nmol·L-1增加细胞生存率10 nmol·L-1没有明显区别，因此选择10、100 nmol·L-1PIC为实验浓度，此浓度范围能有效抑制PTEN并且对细胞没有毒性作用。流式结果显示，10、100 nmol·L-1PIC预处理可以降低高糖诱导的细胞凋亡。PTEN调节胰岛β细胞p16的表达，PTEN敲除可以恢复老化和受损的胰岛β细胞再生[15]。结果显示内皮细胞p16受PTEN调节，10、100 nmol·L-1PIC使p16mRNA 及蛋白表达降低，SA-β-Gal绿色阳性细胞减少。PTEN抑制剂可以降低高糖诱导的内皮细胞衰老。
PTEN和p16是体内的抑癌基因，体内主要是起抑制肿瘤的作用。实验结果表明，高糖作用内皮细胞，抑癌基因表达增加诱导细胞衰老，同时抑制肿瘤的发生。说明体内细胞在不良环境下，诱导细胞衰老，防止肿瘤的产生，这也是体内的一种保护机制。
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