表1(Table 1)
2. 广东药学院 药科学院药理系, 广东 广州 510006;
3. 广东药学院 中山大学新华学院, 广东 广州 510520;
4. 广东省人民医院呼吸内科, 广东 广州 510080;
5. 中山大学第三附属医院脊柱外科, 广东 广州 510630;
6. 广州市南沙中心医院药学科, 广东 广州 511400;
7. 广东药学院第一附属医院, 广东 广州 510080;
8. 中山大学肿瘤防治中心华南肿瘤学国家重点实验室, 广东 广州 510630
2. Pharmacology, School of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China;
3. Xinhua College of Sun-Yat University, Guangzhou 510520;
4. Dept of Respiratory, Guangdong Province Hospital, Guangzhou 510080;
5. The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510630;
6. Medicine Discipline of Guangzhou Nansha Central Hospital, Guangzhou 511400;
7. the First Affiliated Hospital, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510080;
8. State Key Laboratory of Oncology in Southern China, Sun Yat-Sen University Cancer Center, Guangzhou 510630
当今社会快速发展，人们的工作生活压力越来越大，随之产生的焦虑、失眠等症状也不断地困扰着人们的正常生活，失眠人群在成人中非常普遍，长期的失眠是诱发抑郁症、加速衰老、降低机体免疫力诱发癌症等的主要诱因之一。目前用于失眠的镇静、催眠类药物主要有巴比妥类(苯巴比妥等)、苯二氮卓类(地西泮等)、 吡咯酮类非苯二氮类(佐匹克隆等)抗失眠症药物，但这些镇静、催眠类化学药物对中枢神经系统有明显的不良反应，长期使用不但出现耐药性，还有可能加重病情，进而使患者产生耐受性，最终导致治疗失败[1]，因此，研究和开发中药类养心安神药调节睡眠，尤其是模拟生理性睡眠的药物的需求显得日益迫切。
酸枣仁是鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子，分布于我国西北、东北、华北及南方一些地区。酸枣肉中含有大量维生素C 和19 种氨基酸，其中8 种为人体必需氨基酸。在我国，酸枣的药用价值历史悠久，明代大医学家李时珍就曾指出酸枣“久服安五脏，轻身延年”、“补中、益肝、坚筋骨、助阴气、令人肥健”。我国中医理论认为，酸枣仁具有补肝宁心、敛汗生津的功效，用于治疗虚烦不眠、惊悸多、体虚多汗及津伤口渴[2]。有研究证明，酸枣仁对各种病因引起的失眠症和神经衰弱症均有良好的效果，是经典的镇静催眠中药，并且具有疗效稳定、安全等优点[3, 4]。
根据GABA受体对激动剂及拮抗剂的敏感性的不同，目前将GABA受体分为A、B和C三型，这3种受体的分子结构、药理学特性各有所不同。地西泮是BDZ类镇静催眠药，选择性地作用于大脑边缘系统，与中枢BDZ受体结合而促进γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的释放，进而阻止了突触传递功能。GABA是中枢神经系统最重要的抑制性神经递质，也是目前研究最为广泛的与睡眠相关的受体。GABA受体激动剂能够直接或间接通过前脑的慢波活动和外周的张力减退及张力弛缓来促进催眠[5]。本文根据受体-配体结合原理，用高浓度的地西泮竞争低浓度的酸枣仁中的催眠有效成分，并通过HPLC和LC-MS进行定性鉴别，分离出酸枣仁中可与BDZ受体结合的化合物，为研究酸枣仁有效催眠物质基础阐明作用机制和药物靶标奠定了基础。
1 材料 1.1 仪器FW177-中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；FA1004-电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；RE52-99旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D(A)型循环水真空汞(天津华鑫仪器厂)；组织分散机(德国IKA T10 basic ULTRA-TURRAX®)；高速离心机(美国 Thermo Electron Corporation)；DK-8D型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)；1200液相色谱系统(美国Agilent公司)；液相色谱质谱联用仪(Agilent 1100系列液相色谱系统，电喷雾离子源，离子阱质量分析检测系统)。
1.2 试剂与样品酸枣仁药材(湖北圣峰药业有限公司)；地西泮(上海旭东海普药业有限公司)。
1.3 动物♂ Wistar大鼠〔SCXK(粤)2013-0034〕，180~220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供。
2 方法 2.1 中药粗提液的制备取酸枣仁粉碎过20目，称取酸枣仁粉0.05 kg，加10倍量50%乙醇进行冷浸24 h，真空抽滤，滤液用旋蒸仪水浴加热浓缩至10 mL，水浴蒸干。称重，加水溶解，得到浓度为7.5 g·L-1的酸枣仁粗提液。
2.2 脑组织匀浆的制备取♂ Wistar大鼠3只，处死后迅速取出大脑，在PBS缓冲液中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入50 mL烧杯中。用移液枪移取25 mL PBS缓冲液于烧杯中，用眼科小剪快速剪碎组织块。匀浆，4℃离心1 000 r·min-1×5 min，弃去上清液，保留沉淀。
2.3 体外饱和竞争实验将脑BDZ受体组织匀浆液分为3组，分别为酸枣仁组、地西泮组及酸枣仁+地西泮组。
酸枣仁组：取1 mL脑组织匀浆液，加酸枣仁粗提液1 mL(浓度为7.5 g·L-1)。再加PBS缓冲液稀释至5 mL，充分混匀后分别置于4 ℃、25 ℃及37 ℃孵育1 h，通过玻璃纤维微孔滤膜过滤，用5 mL甲醇洗膜4次，保留不能通过微孔滤膜的蛋白质大分子，收集滤液和洗脱液。
地西泮组：取1 mL脑组织匀浆液，加地西泮2 mL(浓度为5 g·L-1)。再加PBS缓冲液稀释至5 mL，充分混匀后分别置于4 ℃、25 ℃及37 ℃孵育1 h，通过玻璃纤维微孔滤膜过滤，用5 mL甲醇洗膜4次，保留不能通过微孔滤膜的蛋白质大分子，收集滤液和洗脱液。
酸枣仁+地西泮组：取1mL脑组织匀浆液，加酸枣仁粗提液1 mL(浓度为7.5 g·L-1)，充分混匀后分别置于4 ℃、25 ℃及37 ℃孵育1 h，再加地西泮2 mL(浓度为5 g·L-1)，加PBS缓冲液稀释至5 mL，混匀后分别置于4 ℃、25 ℃及37 ℃孵育1 h。通过玻璃纤维微孔滤膜抽滤，用5 mL甲醇洗膜4次，保留不能通过微孔滤膜的蛋白质大分子，收集滤液和洗脱液。
2.4 HPLC检测样品处理：将“2.3”中收集得到的3组工作液分别过4.5 μm微孔滤膜，滤液进样。
色谱条件，色谱柱：Agilent Extend C18柱(150 mm×4.6 mm，5)；流动相：乙腈-水(30 ∶70)；柱温为30 ℃；检测波长：204 nm；流速：0.8 mL·min-1；进样量：10 μL。
2.5 HPLC-MS检测样品处理：将“2.3”中收集得到的3组溶液分别过4.5微孔滤膜，滤液进样。
色谱条件，色谱柱：Agilent Extend C18柱(150 mm×4.6 mm，5)；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，采用梯度洗脱，具体程序见Tab 1；柱温为30 ℃；检测波长：204 nm；流速：0.8 mL·min-1；进样量：10 μL。
| Time/min | Moving Phase A | Moving Phase B |
| 0～15 | 20→40 | 80→60 |
| 15～28 | 40 | 60 |
| 28～30 | 40→70 | 60→30 |
| 30～32 | 70→100 | 30→0 |
质谱条件，电离源模式：电喷雾电离源；干燥气：7 L·min-1；雾化气压力：241 kPa；干燥气温度；325 ℃。
3 结果 3.1 HPLC测定酸枣仁催眠有效成分将3组样品分别用HPLC法检测，得到以下图谱。酸枣仁组的HPLC谱图显示，出峰时间为在2.713 min、3.160 min、10.727和46.870 min，见Fig 1A；地西泮组的HPLC谱图出峰时间在3.168和10.711 min，见Fig 1B；酸枣仁+地西泮组的HPLC谱图出峰时间在3.169、10.693 min，见Fig 1C。从3个谱图的对比可以推测，Fig 1A中出峰时间为2.713 min 和46.870 min的化合物为酸枣仁中发挥镇静催眠作用的主要成分。3组样品的出峰情况见Tab 2。
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| Fig 1 HPLC chromatograms of determination of samples A: Semen group;B: Diazepam group; C: Semen+Diazepam group |
| Group | Time/min | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| Semen | 2.713 | 3.160 | 10.727 | 46.870 |
| Diazepam | - | 3.168 | 10.711 | - |
| Semen+Diazepam | 1.648 | 3.169 | 10.693 | - |
本实验采用蒸发光散射检测器检测，三组样品的LC-MS 在正离子扫描模式下的HPLC-MS总离子流色谱图如Fig 2。与地西泮组、酸枣仁+地西泮组的谱图对比，酸枣仁组在Tab 1的洗脱条件下在1.51、7.53和10.36 min出峰，其质谱分析见Fig 3，其中1.51 min的化合物为m/z：453.35、m/z：608.38，7.53 min的化合物为m/z：274.28、m/z：318.30，10.36 min的化合物为m/z： 496.34、m/z：522.35。根据酸枣仁指纹图谱的比对，化合物274.28m/z、453.34m/z、496.34m/z、608.38m/z可能分别为脂肪酸类物质棕榈酸(palmitic acid，C16H32O2)，三萜类化合物麦珠子酸(alphitolic acid，C30H48O4)和斯皮诺素(spinosin，C28H32O15)，化合物318.30 m/z、522.35 m/z暂未发现报道。
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| Fig 2 LC-MS chromatograms of samples A: Semen group; B: Diazepam group; C: Semen+Diazepam group |
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| Fig 3 MS chromatograms of Semen group sample A:MS-1.459 min; B: MS-7.678 min;C:MS-10.362 min |
目前用于治疗失眠组方中包含的中药材频次较多的为酸枣仁。酸枣仁别名枣仁、酸枣核，《神农本草经》列为上品，作为鼠李科植物酸枣的成熟种子分布在全国各地[6]，已有研究表明，酸枣仁具有镇静催眠作用、抗心律失常、改善心肌缺血、降血脂、降血压、免疫增强作用等[7]。而酸枣仁内具有镇静催眠的有效成分包括总生物碱、黄酮类、脂肪酸、三萜类化合物和皂苷类化合物等[8, 9, 10, 11]。
受体理论是药效学的基本理论之一，从分子水平解释生命的生理和病理过程、药物的药理作用机制、药物分子的结构效应关系[17]。受体(receptor)是指一类存在于胞膜或胞内的，能与细胞外专一信号分子结合，进而激活细胞内一系列生物化学反应，使细胞对外界刺激产生相应效应的特殊蛋白质。与受体结合的生物活性物质统称为配体(ligand)。受体配体结合具有特异性、高度亲和力、饱和性、可逆性、可竞争置换性的特点。特异性是受体的最基本特点，保证了信号传导的正确性。配体和受体的结合是一种分子识别过程，它依靠氢键、离子键与范德华力的作用使两者结合，配体和受体分子空间结构的互补性是特异性结合的主要因素。可逆性、可竞争置换性的特点为我们利用已知靶标的化学药物竞争性置换并鉴定出重要单体活性成分奠定了理论基础。
本文检测到的化合物m/z：453与已有研究[12]中关于酸枣仁成分的鉴定结果相接近，可能为酸枣仁中的羽扇豆丸型三萜类化合物。化合物m/z：608[M]与刘朋朋[13]对酸枣仁化学成分的研究相一致，该化合物可能是三萜类化合物斯皮诺素(Spinosin，C28H32O15)；化合物m/z：274[M+18]与已有的研究[14]结果一致，可能为酸枣仁中脂肪酸类化合物——棕榈酸(Palmitic acid，C16H32O2)；另外，化合物m/z：496[M+23]也可能是酸枣仁中的三萜类化合物麦珠子酸(Alphitolic acid，C30H48O4)，与曾路[9]的研究结果相一致。1957年，黄文兴等[15]研究有关酸枣仁的药效学实验时发现，用酸枣仁灌胃大白鼠，不管白天或者黑夜，病态或者正常均可抑制其中枢神经系统，表现出镇静催眠作用。国内外虽然已有大量文献报导有关酸枣仁活性成分和药理作用研究，但对酸枣仁中催眠有效成分的镇静催眠机制尚未见。利用受体配体结合HPLC/HPLC-MS研究其中的镇静催眠有效成分更未见文献报道。
GABA对哺乳动物的神经元有抑制作用，是神经系统中极为重要的一种神经递质，可起到镇静、催眠、抗焦虑、抗癫痫等作用。苯二氮卓类药物尤其是地西泮通过与BDZ受体结合，起到兴奋神经元作用，促进GABA与GABAA受体的结合而使Cl-通道开放的频率增加，更多的Cl-内流，使神经细胞超极化，产生突触后抑制效应，是最常用的调节睡眠的药物[16]。
为避免传统实验先利用各种不同的有机溶剂萃取、大孔树脂、C18柱等现代工艺逐个分离各种组分，再验证各组分活性并表征化学结构的繁琐步骤。本实验通过地西泮与酸枣仁提取物的GABA-BDZ受体竞争结合，实验发现，酸枣仁催眠有效成分作为BDZ受体地西泮结合部位配体起到镇静催眠作用，这为酸枣仁催眠物质基础和确切机制的进一步研究奠定基础。通过GABA-BDZ结合实验也为研制新型镇静催眠药物提供一种新的思路。根据受体配体结合的核心技术原理建立了一种可以快速分析和鉴定天然产物中的作用于特征药靶的化合物的新方法，达到了既可以明确候选天然产物中的活性有效成分，同时又可以阐明该化合物的作用机制/药物靶标，对于中药现代化研究具有重要意义。
(致谢:本文是在广东药学院药科学院新药筛选与药效学评价中心完成的，感谢叶晓琼同学对本论文做出的重要贡献。)
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