表1(Table 1)
2. 沈阳医学院附属第二医院内分泌科, 辽宁 沈阳 110002
2. Dept of Endocrinology, the 2nd Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110002, China
乳腺癌是威胁女性健康的常见恶性肿瘤之一，近年来发病率已居全球女性恶性肿瘤首位。据临床统计，乳腺癌患者中0.7~0.8为雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性乳腺癌[1]，因此针对乳腺癌ER及其信号转导通路的研究成为探究乳腺癌发生、发展原因的重要内容。瘦素(Leptin)是由167个氨基酸组成的16 ku蛋白质。它通过与相应受体OB-Rb结合而发挥其生物学效应。由于机体内Leptin水平和乳腺癌发生有着千丝万缕的联系，它可作为一种独立危险因素参与乳腺癌的形成过程[2]。研究表明，人乳腺癌细胞系MCF-7有OB-Rb表达，并且Leptin可影响MCF-7细胞的生长，这可能与Leptin诱发乳腺上皮细胞分泌生长因子，加速乳腺癌细胞周期进程有关[3]。
随着研究的不断深入，人们发现乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化、糖基化等表观遗传性状改变在乳腺癌发生、发展中具有重要的调控作用。其中乙酰化修饰主要是影响基因转录活性，对基因组DNA序列无改变[4]。在正常乳腺细胞中，组蛋白乙酰化转移酶(histone acetyltransferase,HAT)将乙酰辅酶A上的疏水乙酰基部分转移至染色质核心组蛋白氨基末端上特定赖氨酸残基上，使DNA易于解聚、舒展，从而激活特定基因的转录。而组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)则通过移去组蛋白氨基末端赖氨酸残基的乙酰基而抑制基因的转录。在乳腺细胞功能异常时，HDAC的活性明显增强，组蛋白处于低乙酰化状态，基因表达平衡状态被破坏，使一些调控细胞增殖、分化、凋亡的基因表达失衡，导致乳腺癌的形成[5, 6]。
SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)作为继HMBA(hexamethy lenebisacetamide)之后的第2代羟肟酸类的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，主要用于治疗持续恶化或复发的T细胞淋巴瘤(CTCL)[7]。在本实验中，我们将观察SAHA对Leptin诱导的乳腺癌ER+细胞系MCF-7细胞增殖的影响，阐明SAHA调控Leptin诱导的乳腺癌MCF-7细胞增殖的分子机制。
1 材料与方法 1.1 材料人乳腺癌细胞株MCF-7购自美国ATCC细胞库；RPMI 1640培养基，胎牛血清、青霉素以及链霉素购自美国Thermo公司；SAHA和人重组Leptin蛋白购自美国Sigma-Aldrich公司；Muse Cell Cycle kit、Muse Annexin & Dead Cell kit、Muse Count & Viability kit 试剂盒购自德国Merck Millipore公司；人固相凋亡抗体芯片试剂盒购自美国R&D公司；其它化学试剂购自美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养将人乳腺癌MCF-7细胞用含0.1胎牛血清的RPMI 1640培养液(含100 mg·L-1青、链霉素)体积分数为0.05的CO2、37 ℃饱和湿度下培养。
1.2.2 实时细胞增殖检测将1×107·L-1乳腺癌MCF-7细胞接种于xCELLigence实时无标记动态细胞分析系统的E-Plate 96板(Roche)各孔中，待细胞进行无血清同步化处理后，各孔分别加入不同浓度的Leptin(0、0.625、1.25、2.5、6.25、12.5、62.5 nmol·L-1)进行孵育，以DMSO为对照组。通过xCELLigence系统中各孔微电阻量的变化动态监测0~60 h范围内的细胞生长状况。通过每孔中细胞指数(cell index,CI)的变化了解MCF-7细胞的生长情况，实验重复3次。
1.2.3 细胞活力检测将5×108·L-1乳腺癌MCF-7细胞接种于6孔板各孔中，无血清培养液同步化处理后加入0.625 nmol·L-1 Leptin和20 μmol·L-1 SAHA与MCF-7细胞共同孵育32 h。细胞活力及细胞计数实验参照试剂盒程序进行。将与Leptin和SAHA孵育后的细胞经胰酶消化，收集的2×105个细胞加入450 μL Count & Viability reagent静置5 min后应用自动细胞分析仪Muse Cell Analyzer(Millipore)进行检测。
1.2.4 细胞凋亡检测按“1.2.2”方法将Leptin和SAHA与MCF-7细胞共同培养32 h后，收集1×106个细胞，与100 μL Muse Annexin V & Dead Cell reagent室温孵育20 min。应用自动细胞分析仪Muse Cell Analyzer检测各处理因素诱导MCF-7细胞凋亡发生的情况。
1.2.5 细胞周期检测按“1.2.2”方法将Leptin和SAHA与MCF-7细胞共同培养32 h后，将收集的细胞300×g离心5 min后加入1 ml预冷的体积分数为0.7的乙醇-20 ℃过夜孵育。将乙醇固定后的MCF-7细胞加入200 μL Muse Cell Cycle reagent室温避光静置30 min后，通过自动细胞分析仪Muse Cell Analyzer测定细胞周期。
1.2.6 固相凋亡抗体芯片检测将大约1×107个经Leptin和SAHA处理后的MCF-7细胞按抗体芯片试剂盒程序进行裂解，14 000×g离心5 min后，应用BCA蛋白分析试剂盒测定Leptin和SAHA各处理组样品的蛋白浓度。将200 μg蛋白样品液加入已放有抗体包被PVDF膜的4孔板，各孔中4 ℃振荡过夜。然后将蛋白样品-抗体膜经PBS冲洗后分别加入1.5 mL生物素标记的二抗振荡孵育1 h。PVDF膜经冲洗后加入HRP偶联的链霉亲和素孵育30 min。将等体积混合的ECL化学发光底物A、B 液均匀加在PVDF膜上，显色5 min。化学发光成像系统曝光后，应用Gelpro Analyzer software(Media Cybernetics)计算膜上各抗体标记点的灰度值来决定Leptin和SAHA各处理组对MCF-7细胞凋亡蛋白表达的影响。
1.3 统计学处理应用Student′s t-test分析软件进行统计处理，结果以x±s表示，采用单因素方差分析方法。
2 结果 2.1 Leptin诱导乳腺癌细胞增殖的实时监测为了解Leptin对乳腺癌ER+细胞MCF-7的诱导作用，我们应用xCELLigence RTCA分析系统实时观测不同浓度Leptin对MCF-7细胞生长状态的影响。从Fig 1中可以看出，低浓度Leptin对MCF-7细胞生长有刺激作用，0.625~6.25 nmol·L-1的Leptin都表现出较明显的诱导细胞生长的效应，其中以0.625 nmol·L-1浓度的Leptin产生的诱导作用最明显。但随着Leptin作用时间的延长，标示细胞生长的CI曲线在孵育48 h后趋于一致，由此在本实验中我们选定0.625 nmol·L-1浓度的Leptin为诱导MCF-7生长的最适浓度，32 h为Leptin作用MCF-7细胞的最适处理时长。另外我们还发现，高浓度Leptin(12.5或62.5 nmol·L-1)处理的MCF-7细胞，其CI曲线明显下降，这说明高浓度Leptin对MCF-7细胞具有毒性作用，可明显抑制MCF-7细胞的生长。
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| Fig 1 Real-time cell proliferation assays on differentconcentrations of leptin for MCF-7 breast cancer cells |
为了更直观探究Leptin和SAHA对乳腺癌ER+细胞MCF-7生长状态的影响，我们分别应用0.625 nmol·L-1 Leptin和先前实验测定的针对MCF-7最适SAHA浓度(20 μmol·L-1)与MCF-7细胞孵育32 h后测定细胞活力和细胞凋亡。细胞活力检测结果显示：与DMSO对照组相比，经SAHA单独处理后乳腺癌MCF-7细胞活力明显下降，活细胞比率从0.86下降到0.76，而死细胞比率由0.14上升到0.24，与此对应的是Leptin处理后活细胞比率上升至0.95，表明Leptin诱导细胞生长的效果很明显(Fig 2A)。细胞凋亡检测结果显示：与DMSO对照组相比，SAHA处理后的MCF-7细胞出现明显的细胞凋亡，细胞的早、晚期凋亡诱导率分别达到0.04和0.45，而Leptin处理后的MCF-7细胞早、晚期凋亡诱导率则为0.01和0.04(Fig 2B)。
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| Fig 2 Effect of Leptin and SAHA treatment on cell viability and apoptosis of MCF-7 breast cancer cell |
我们观察了Leptin和SAHA对MCF-7细胞周期产生的影响。结果发现，Leptin和SAHA对MCF-7细胞周期的影响程度有明显的不同。经SAHA处理后，MCF-7细胞大多被阻抑于G0/G1期，G0/G1期细胞比率从DMSO对照组的0.69上升到0.81，S期细胞比率从0.21下降到0.10，而G2/M期比率无明显变化；Leptin处理后MCF-7细胞G0/G1期、G2/M期细胞比率分别下降到0.58和0.03，而S期比率则上升到0.39(Fig 3)。这说明Leptin和SAHA对MCF-7细胞周期的影响主要集中在S期，对G2/M期进程的影响不明显。
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| Fig 3 Effect of Leptin and SAHA on distribution of cell cycle in MCF-7 breast cancer cell |
为了明确Leptin和SAHA对乳腺癌MCF-7细胞凋亡影响的途径，我们应用固相细胞凋亡抗体芯片，测定了Leptin和SAHA两种处理因素对MCF-7细胞凋亡相关蛋白表达所产生的变化。结果表明，单独SAHA处理可明显诱导MCF-7细胞内促凋亡因子Bax、Caspase-3的表达，并抑制Claspin、Clusterin、XIAP、Survivin蛋白的表达，与对照组相比差异具有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)；而Leptin则作用相反，经0.625 nmol·L-1 Leptin作用后，MCF-7细胞的Bax、Caspase-3的表达明显下降，而Clusterin、Claspin、XIAP、Survivin的表达明显上升，与对照组相比其差异具统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。另外我们还发现，与凋亡产生密切相关的TRAIL DR5、p21CIP1在SAHA的作用下也明显升高(Fig 4，Tab 1)。
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| Fig 4 The transduction pathway screening for breast cancercell apoptosis induced by leptin and SAHA treatment *P < 0.05,**P < 0.01 vs Basal |
| Leptin | SAHA | Leptin+SAHA | |
| Bax | 0.49±0.03 | 2.27±0.13 | 3.74±0.01 |
| Caspase-3 | 0.51±0.00 | 1.52±0.05 | 1.77±0.13 |
| Claspin | 2.13±0.02 | 0.53±0.23 | 0.98±0.05 |
| Clusterin | 1.47±0.05 | 0.58±0.01 | 0.88±0.10 |
| TRAIL DR4 | 1.50±0.04 | 0.26±0.14 | 0.61±0.05 |
| TRAIL DR5 | 0.70±0.03 | 1.60±0.09 | 3.09±0.00 |
| p21 CIP1 | 0.72±0.01 | 1.54±0.08 | 2.64±0.01 |
| Survivin | 2.28±0.00 | 0.20±0.06 | 0.90±0.03 |
| XIAP | 1.44±0.05 | 0.35±0.03 | 0.69±0.01 |
雌激素受体阳性乳腺癌作为最主要的乳腺癌类型，研究其特有的生物学特性，进而完善其内分泌治疗手段和寻找抑制其转移的新方法都具有重要的临床价值。
近年来，发现瘦素作为重要的脂肪因子广泛参与多种肿瘤如卵巢癌、乳腺癌、肾癌等的发生、发展过程。有研究指出瘦素可作为乳腺癌一种新的促生长因子诱导乳腺癌细胞增殖，且与乳腺癌分期、转移密切相关，参与乳腺癌的发生发展全过程[8]。在本实验中，我们应用外源性Leptin与人乳腺癌ER+细胞MCF-7共同孵育，发现低浓度Leptin(0.625~6.25 nmol·L-1)可明显刺激MCF-7细胞生长，其中0.625 nmol·L-1 Leptin诱导增殖的效果最明显。相关细胞学实验显示，在0.625 nmol·L-1 Leptin诱导下，MCF-7细胞活力增强，细胞凋亡发生率下降，进入S期细胞增多。这些数据都从不同角度证实了Leptin确实有诱导乳腺癌MCF-7细胞增殖的特性，并且Leptin可能通过自分泌或旁分泌方式扩大传播增殖信号以促进乳腺癌细胞的转移。
肿瘤的发生、发展是多因素作用的结果，其中离不开表观遗传学病因的作用。组蛋白乙酰化修饰是表观遗传学中的重要组成部分，当去乙酰化酶活性增强时组蛋白低乙酰化，阻碍基因转录的启动子结合蛋白进入启动子结合位点，从而抑制特定基因的转录。近年来，相关乳腺癌Ⅱ期临床试验发现，SAHA表现出良好的抑瘤疗效[9]。在本实验中，SAHA也显示出明显的抑制MCF-7增殖的特性。经20 μmol·L-1 SAHA处理MCF-7细胞后，细胞活力明显降低，早晚期细胞凋亡发生率明显增多，细胞周期检测结果显示，SAHA处理后MCF-7细胞被大量阻滞于G0/G1期。
为了探究Leptin、SAHA对乳腺癌ER+细胞的影响，我们应用固相细胞凋亡蛋白芯片筛查了Leptin、SAHA作用MCF-7细胞后相关凋亡因子表达的变化。从结果中可以看出，在Leptin的作用下，MCF-7细胞内Bax、Caspase-3的表达明显降低，XIAP、Survivin、Clusterin表达增加；而SAHA处理后的细胞Bax、Caspase-3的表达明显上升，XIAP、Survivin、Clusterin表达下降。Bax是一种重要的凋亡促进因子，它可形成二聚体并抑制Bcl-2、Bcl-x的表达而促进凋亡的产生[10]。Caspase-3作为凋亡过程中最重要的关键反应元件，是细胞凋亡的主要执行者和效应分子，是多种凋亡激活信号传递的汇集点，它的活化是凋亡发生进入不可逆阶段的标志[11]。而Survivin作为凋亡抑制因子，可直接抑制Caspase-3、Caspase-7的活性，从而抑制凋亡，有利于癌细胞的异常增殖和恶性转化[12]。XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein)是凋亡抑制蛋白家族成员，可通过抑制凋亡信号转导途径中Caspase分子的活性而对细胞凋亡产生抑制作用[13]。Clusterin可通过与细胞质中Bax共同作用抑制细胞色素C的释放而达到保护细胞的目的[14]。因此，从本实验结果可以看出，Leptin、SAHA对乳腺癌ER+细胞MCF-7的影响可能与乳腺癌细胞内凋亡通路是否激活，特别是内源性线粒体凋亡通路引发的Caspase-3释放密切相关。
在本实验中，当用Leptin或SAHA处理MCF-7细胞后，TRAIL DR5受体表达发生明显变化。TRAIL DR受体是TRAIL (TNF related apoptosis-inducing ligand)功能受体，负责传递细胞外凋亡信号，激活细胞内多种诱导细胞凋亡蛋白的表达。有研究证实，在乳腺癌组织中TRAIL的表达远低于正常乳腺组织，而DR受体也呈现低表达，这提示乳腺癌的发生可能与TRAIL失活有关，也可能与TRAIL受体表达低引起的凋亡信号传递不足出现凋亡逃逸有关[15]。在本实验中，Leptin抑制了MCF-7细胞表面TRAIL DR5受体的表达，而SAHA处理后TRAIL DR5受体表达明显上升。因此，我们推测，在Leptin或SAHA作用乳腺癌MCF-7细胞过程中，TRAIL DR5受体介导的外源性死亡受体通路可能参与了相应的生物学作用。
综上所述，在本实验中，我们系统地研究了Leptin、SAHA对乳腺癌ER+细胞系MCF-7细胞活力和细胞凋亡变化的影响，通过形态学观察、细胞周期测定了解Leptin、SAHA对MCF-7细胞增殖的作用，并应用凋亡抗体芯片探讨了Leptin、SAHA作用MCF-7细胞后相关凋亡通路及分子表达变化的情况，我们的研究工作有助于深入理解SAHA调控Leptin诱导的乳腺癌MCF-7细胞增殖的分子机制，为不远的将来研发新型抗乳腺癌药物奠定一定的理论和实验基础。
(致谢：衷心感谢沈阳医学院“辽宁省环境污染与微生态重点实验室”为本实验提供的实验资源及实验设备；感谢实验室全体工作人员对本实验的大力协助。)
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