阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以认知障碍为其主要特征的进行性神经系统退行性疾病，其典型的病理改变为神经细胞间出现以β-淀粉样肽(β-amyloid,Aβ)为核心的老年斑(senile plaques,SP)及神经元丢失等[1]。盐酸美金刚(memantine hydrochloride,MEM)作为第一个美国FDA批准用于治疗中、重度AD的药物，是一种新型、低度亲和力、电压依赖、非竞争性NMDA(N-methyl-D-aspastate)受体拮抗剂，临床研究显示可明显改善中、重度AD患者的认知、行为障碍[2, 3, 4]，其机制与通过非竞争性阻断NMDA受体，降低谷氨酸引起的NMDA受体过度兴奋，阻断谷氨酸兴奋性毒性，改善学习记忆能力有关[5, 6]。然而，有研究表明，美金刚改善AD还与促进脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达，兴奋M受体有关[7, 8]，这提示着MEM可能存在多种神经保护机制的可能性。
神经生长因子(nerve growth factor,NGF)作为一种具有支持神经元发育、分化、维持及营养等生物学效应的神经营养因子家族中的一员，脑内NGF的缺乏将导致胆碱能神经元凋亡、死亡及功能降低，并可抑制Aβ沉积，降低Aβ的神经毒性[9, 10]。然而，美金刚是否能通过调节NGF相关通路，调控胆碱能神经元功能，影响Aβ沉积，从而发挥其改善学习记忆障碍的神经保护作用，尚未见相关研究报道。因此，本研究拟对美金刚改善APP/PS1转基因小鼠学习记忆障碍、降低Aβ沉积的神经保护作用进行考察，并进一步研究美金刚对APP/PS1转基因小鼠NGF/TrkA信号转导通路的影响及二者的相关性进行研究，旨在发现美金刚防治AD作用可能的新作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物C57 BL/6J 小鼠10只，♀♂各半，12月龄，(26±4)g；APP/PS1转基因小鼠20只，♀♂各半，12月龄，体质量(23±3) g，由中国医科大学实验动物中心提供。实验过程中的动物饲养及取材均遵守实验动物管理和保护的有关规定。
1.2 药物处理对照组(WT组)：12月龄C57 BL/6J小鼠10只，♀♂各半，每日等量于实验组的双蒸水灌胃，每日1次，连续灌胃4周；模型组(APP/PS1组)：12月龄APP/PS1转基因小鼠10只，♀♂各半，每日等量于实验组的双蒸水灌胃，每日1次，连续灌胃4周；治疗组(MEM-treated APP/PS1组)：12月龄APP/PS1转基因小鼠10只，♀♂各半，每天按5 mg·kg-1体重灌胃400 mg·L-1的MEM水溶液(购自Sigma公司)，每日1次，连续灌胃4周。4周给药结束后，即可开始行为学试验，行为学试验结束后，处死动物，取皮质及海马，并进行组织固定。
1.3 行为学试验 1.3.1 避暗试验4周给药结束后，开始被动避暗试验，分为训练和正式试验两个阶段：训练前将小鼠头背着洞口放入明室(BA-200避暗自动测试仪，成都泰盟科技有限公司)，先适应环境3 min，然后给暗室铜栅通以36 V电流，小鼠一进入暗室即受电击，其正确反应是回到明室，铜栅通电持续5 min，此为训练过程。24 h后对小鼠进行记忆测验，记录小鼠第一次进入暗室的时间，此为避暗潜伏期，并记录5 min内小鼠进入暗室的次数(即避暗穿梭错误次数)，5 min内未进入暗室的小鼠其潜伏期按300 s计算。
1.3.2 Morris水迷宫试验在被动避暗试验结束后，开始Morris水迷宫试验(Morris水迷宫装置，北京硕林苑生物科技有限公司)，分为训练期、定向航行试验和空间搜索试验3部分进行。训练期：在定向航行试验前1 d，水池中不放置平台，使小鼠在水中自由游泳2 min，使其适应环境。定向航行试验：进行定向航行试验时，将平台放在固定的第二象限。该试验训练小鼠每天4次，共5 d。训练时，将小鼠面向池壁从4个入水点分别放入水池，记录鼠入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需时间，作为潜伏期(latency)，用s表示，并记录从小鼠入水至找到平台通过路径的总长度，用cm表示。小鼠找到平台后，让其在平台上站立30 s。若入水后60 s若小鼠仍未能找到平台，则将其轻轻从水中引导拖上平台，并停留30 s，然后进行下一次训练。每只鼠从4个入水点分别放入水池为1次训练，两次训练之间间隔120 s。空间搜索试验：在定向航行试验结束后，即d 6，将平台撤去，使其在水中寻找原平台所在位置，共120 s，记录从小鼠第1次到达平台原来所在位置的时间(latency)，用s表示，以及小鼠穿越原平台的次数，来评价小鼠记忆重现的能力。
1.3.3 自主活动试验将小鼠放入自主活动箱中(ZZ-6小鼠自主活动测试仪，成都泰盟科技有限公司)，记录小鼠10 min内自主活动次数(locomotivity)和站立次数(stand-up)。
1.4 免疫组化法检测小鼠脑组织中APP和Aβ(1-40)蛋白表达行为学实验结束24 h后，将各组小鼠3只以水合氯醛麻醉并先以200 mL生理盐水心室内灌流，继而更换以4%多聚甲醛溶液灌流，取脑固定24 h，常规石蜡包埋、切片，进行免疫组化染色。切片进行脱蜡，水化，3%的H2O2于37℃孵育20 min，微波修复，正常山羊血清封闭液37℃封闭30 min，一抗抗体Aβ1-42抗体(1 :1 000，购自CST公司)4℃孵育过夜，PBS洗后，SP法二抗37℃孵育1 h，DAB显色，每张切片随机数脑组织3个视野，用计算机图像分析系统分别测定各组小鼠每张切片内表达阳性蛋白神经元的整合光密度值，以反映考察Aβ1-42阳性蛋白表达水平。
1.5 Western blot检测小鼠海马组织中相关蛋白表达取各组3只小鼠海马组织，放入预冷的RIPA Buffer裂解缓冲液(50 mmol·L-1 Tris-HCl buffer pH 8.0 containing 150 mmol·L-1 NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，0.1% sodium dodecyl sulphate，购自碧云天生物技术研究所)；0.1% phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF，购自Roche公司)中，冰上匀浆后，4℃ 12 000×g×30 min，取上清，BCA法蛋白定量(BCA试剂盒，购自碧云天生物技术研究所)。每孔蛋白上样量50 μg，SDS-PAGE电泳分离蛋白并电转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉或5% BSA的PBST中室温封闭2 h，一抗4℃过夜，兔抗NGF抗体(1 :400，购自Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗TrkA、phospho-TrkA抗体(1 :1 000，购自CST公司)；兔抗c-raf、phospho-c-raf、ERK1/2、phospho-ERK1/2(均为1 :1 500，购自CST公司)；兔抗CREB1、Phospho-CREB1抗体(1 :500，购自Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗Aβ1-42抗体(均为1 :1 000，购自CST公司)，兔抗或鼠抗β-actin(1 :2 000，1 :2 000,购自Santa Cruz Biotechnology公司)中4℃过夜。PBST冲洗10 min×3遍，将膜放入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或鼠IgG(1 :2 000)中，室温中摇床振荡60 min，用PBST洗膜10 min×3遍，ECL显影(Super ECL Plus超敏发光液购自北京普利莱基因技术公司)。
1.6 小鼠海马组织中ChAT和t-ChE活性测定取各组3只小鼠海马组织，放入预冷的生理盐水中，冰上超声匀浆后，制成10％(W/V)的匀浆，2 000×g 4℃离心10 min，取上清，BCA法蛋白定量(BCA试剂盒，购自碧云天生物技术研究所)后，根据试剂盒说明书检测t-ChE及ChAT活性(t-ChE及ChAT检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所)。
1.7 数据处理试验数据采用SPSS16.0统计分析软件包进行统计学处理，数据以x±s表示。组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两两比较采用Turkey ′s post hoc test法进行统计学分析；行为学试验中穿梭次数及错误次数，使用非参检验 Kruskal-Wallis H test法进行统计学分析。
2 结果 2.1 MEM可明显改善APP/PS1小鼠的学习记忆能力为了研究MEM对APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响，分别采用被动避暗试验(PAT)、Morris水迷宫试验(MWM)及自主活动试验(LCT)来考察各组小鼠的与学习记忆相关的行为学改变。
首先，我们采用PAT法对各组小鼠经训练后的避暗潜伏期(Fig 1A)和进入暗室错误次数(Fig 1B)进行了考察。结果显示，MEM使APP/PS1小鼠的避暗潜伏期明显延长(P<0.01)，进入暗室的次数明显减少(P<0.01)，初步说明MEM可改善APP/PS1转基因小鼠的学习记忆障碍。
接着，通过Morris水迷宫试验连续5 d考察定向航行试验中寻找平台潜伏期(Fig 2A)和寻找路径长度(Fig 2B)的变化，结果显示在定位巡航试验的d 1，各组小鼠的寻找平台潜伏期及路径长度差异无统计学意义(P>0.05)；而在d 2~5定位巡航试验的学习过程以后，MEM可使APP/PS1组小鼠的寻找平台潜伏期和路径长度明显缩短(P<0.05)，并呈现出明显的学习与记忆的获得曲线。在d 6撤去平台后的空间探索实验中，继续考察各组小鼠在原平台所在目的象限的停留时间(Fig 3A)，以及原平台所在位置的穿梭次数的差异(Fig 3B)对其记忆再现能力的影响，结果发现，MEM可明显延长APP/PS1小鼠在目的象限的停留时间和穿梭次数(P<0.01)，这进一步说明MEM可改善APP/PS1小鼠的学习记忆障碍。
最后，应用自主活动试验考察各组小鼠的自主活动次数(Fig 4A)和站立次数(Fig 4B)的差异。结果显示，各组小鼠的10 min内站立次数和自主活动次数差异均无显著性(P>0.05)，提示APP/PS1小鼠的活动能力未受影响，即上述行为学指标的改变是由于学习记忆障碍所引起的，而不是由于小鼠活动能力的改变而引起的。
2.2 MEM明显降低APP/PS1转基因小鼠海马内Aβ1-42沉积前述的试验结果已证实，MEM可改善APP/PS1小鼠的学习记忆障碍，而APP/PS1小鼠的学习记忆障碍又与Aβ沉积密切相关。因此，我们又采用免疫组化法对MEM是否能够影响APP/PS1小鼠海马和皮质中AD特异性病理标志物Aβ1-42沉积进行了考察。通过对Aβ1-42的研究发现(Fig 5)，APP/PS1组小鼠海马及皮质Aβ1-42阳性细胞表达明显增加，而MEM可明显降低APP/PS1组小鼠皮质Aβ1-42阳性细胞表达(P<0.01)，提示MEM可改善APP/PS1小鼠皮质的Aβ1-42沉积。
2.3 MEM可提高APP/PS1转基因小鼠海马和皮质内ChAT和t-ChE的表达水平AD小鼠脑内胆碱能神经元功能降低，MEM作为抗AD经典药物，是否对胆碱能神经元具有改善作用？这成为下一个我们关注的问题。我们对胆碱能神经元功能相关酶ACh生成的限速酶ChAT及水解酶t-ChE的表达水平进行了考察。研究发现，MEM可明显增加APP/PS1组小鼠前叶皮质ChAT的活性(P<0.01，Fig 6A)，同时明显降低其水解酶t-ChE的活性(P<0.05，Fig 6B)，提示MEM可通过提高ChAT，并降低t-ChE的活性，增加ACh的生成。
2.4 MEM调节APP/PS1转基因小鼠海马内NGF相关TrkA/p75NTR信号通路的平衡发挥其抗AD作用如前所述，MEM抑制神经细胞凋亡作用，从而发挥其神经保护作用，而也有研究表明MEM可增高脑内BDNF的表达水平[27]，提示MEM可能亦对神经元功能相关的神经营养因子有提高作用。而NGF作为一种神经营养因子，有大量研究已表明其对胆碱能细胞发挥营养支持及抑制细胞凋亡作用[19, 20, 28]。因此，我们以Western blot法考察了各组小鼠脑内NGF的表达水平，考察MEM提高胆碱能神经元的功能是否与神经生长因子NGF相关。结果显示，MEM可明显增加APP/PS1组小鼠海马内NGF蛋白表达水平(P<0.01，Fig 7A)，表明MEM可上调APP/PS1小鼠海马内低NGF状态。进而，我们对NGF相关TrkA信号通路及其下游底物进行了考察，发现MEM可明显增加APP/PS1小鼠海马内TrkA(P<0.01，Fig 7B)、c-Raf(P<0.01，Fig 7C)、ERK1/2(P<0.01，Fig 7D)、CREB(P<0.01，Fig 7E)的磷酸化水平，但总蛋白水平不变，提示MEM通过激活NGF-TrkA信号通路，促进其下游ERK通路及与学习记忆相关底物CREB的激活，从而改善学习记忆能力。
3 讨论盐酸美金刚是一种治疗中、重度AD的药物，能够明显改善AD患者的学习记忆能力[11, 12]。我们的研究结果也显示，美金刚可改善12月龄APP/PS1转基因AD小鼠的的学习记忆障碍(Fig 1~4)，并可降低其脑皮质内Aβ1-42表达水平(Fig 5~6)。这一结果与Alley等[13]、Nagkura等[14]与Arif等[15]研究发现的美金刚可降低AD细胞模型及APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ1-42的水平的研究结果显示了一致性[16]。
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| Fig 1 MEM treatment increased latency(A) and reduced frequencies of entering dark compartment (B) in APP/PS1 mice in PAT(n=10) **P<0.01 vs WT group;##P<0.01 vs APP/PS1 group |
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| Fig 2 MEM treatment improved escape latency(A) and path length(B) of APP/PS1 mice in navigation test(n=10) **P<0.01 vs WT group;#P<0.05,##P<0.01 vs APP/PS1 group |
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| Fig 3 MEM treatment prolonged time spent in target quadrant(A) and increased frequencies of passing through goal(B) of APP/PS1 mice in probe trial(n=10) **P<0.01 vs WT group;##P<0.01 vs APP/PS1 group |
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| Fig 4 MEM treatment did not affect locomotivity(A) and frequencies of stand-up(B) of APP/PS1 mice in locomotivity test(n=10) |
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| Fig 5 MEM treatment ameliorated overexpression of Aβ1-42 in brains of APP/PS1 mice by immunohistochemical staining(n=3) A:The typical immunohistochemical figures;B:The statistical results;**P<0.01 vs WT group;##P<0.01 vs APP/PS1 group |
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| Fig 6 MEM treatment elevated activities of ChAT(A) and decreased activities of t-ChE(B) in prefontal cortex of APP/PS1 mice(n=3) sup>**P<0.01 vs WT group;#P<0.05,##P<0.01 vs APP/PS1 group |
美金刚可通过轻度非竞争性阻断NMDA受体而发挥神经保护作用，但与其他临床试验失败的非竞争性NMDA拮抗剂如Dizocilpine[(+)MK-801]、Cerestat(CNS-1102)、Licostinel(ACEA 1021)、Selfotel(CGS-19755)和d-CPP-ene相比[17]，美金刚除了阻断NMDA受体外，美金刚还可通过降低AD动物脑内的Aβ沉积，保护海马神经元不受Aβ细胞毒性作用[13, 17, 18]，同时，亦可抑制LTP，改善大鼠学习记忆障碍[19]，还可促进脑内BDNF表达，兴奋M受体[7, 8]，这提示MEM的抗AD作用存在多种可能保护机制。因此，本研究首次以美金刚调控脑内，NGF相关通路这一新的作用机制，对MEM改善12月龄(相当于中、重度AD)APP/PS1转基因小鼠的学习记忆障碍及抑制脑内Aβ沉积的作用机制及其相关性进行了研究。
NGF作为一种主要的神经营养因子，对神经元主要起营养、支持作用，并可影响Aβ沉积，降低Aβ毒性，与学习记忆密切相关[16, 17, 20, 21, 22]。又有研究表明，NGF的合成主动依赖于NMDA受体的调控[23, 24]，内源性NGF与胆碱能系统功能密切相关[22]。因此，我们考察了MEM对APP/PS1转基因小鼠脑内NGF的影响，并同时对胆碱能神经元活性标记物ChAT及ACh水解酶t-ChE进行了考察，发现MEM可上调APP/PS1转基因小鼠脑内NGF的表达水平，同时增加ChAT的活性，降低t-ChE的活性，提高了乙酰胆碱的表达(Fig 6~7A)。
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| Fig 7 MEM treatment increased NGF expression(A),and activated NGF/TrkA signaling by increasing phosphorylation levels of TrkA(B),c-Raf(C) and ERK1/2(D), finally upregulated phosphorylation level of CREB(E) downstream in hippocampus of APP/PS1 mice by Western blot(n=3) **P<0.01 vs WT group;##P<0.01 vs APP/PS1 group |
已知NGF可通过激活其高亲和力受体TrkA信号通路，调节细胞分化和生存，其下游底物CREB蛋白的磷酸化和激活，可阻断Aβ的寡聚化和形成，降低Aβ的神经毒性[25]。以上提示，NGF/TrkA通路不仅与细胞生存密切相关，亦同时参与了抑制Aβ沉积过程，从而在AD过程中发挥着重要的作用。因此，我们发现MEM在上调NGF表达的基础上，对NGF介导的高亲和力受体TrkA信号通路与低亲和力受体p75NTR信号通路进行了考察，以期探讨MEM的抗AD作用是否与NGF及其信号通路活化相关。研究结果发现，MEM可使NGF高亲和力功能性受体TrkA的磷酸化增加，并进一步激活其下游c-Raf和ERK1/2等蛋白的磷酸化，活化了促进细胞分化和生存的ERK信号传导通路，但总蛋白水平不变(Fig 7)。这与Williams等[26]发现向出现记忆障碍的老年大鼠脑内注射NGF可增加基底前脑TrkA水平，并激活MAPK途径，且ERK总蛋白水平不变的结果是一致的。同时，本研究亦发现MEM通过激活NGF/TrkA信号通路而增加其下游与学习记忆密切相关底物CREB的磷酸化(Fig 8D)，这与Autio等[27]发现的腹腔注射胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐和加兰他敏可增加成年小鼠海马内的TrkA磷酸化水平，进而增加CREB磷酸化水平的研究结果也是保持一致的。
综上结果，MEM可能通过增加NGF的表达，激活TrkA信号通路，降低APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ1-42蛋白沉积，从而改善其学习记忆障碍。
(致谢：本实验在中国医科大学药理教研室完成，感谢魏敏杰教授和刘明妍教授的悉心指导，同时感谢钟欣、杨时伦、杜可、毛瑞琨的参与和帮助。)
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