帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种退行性神经系统疾病，这种疾病的特征是黑质致密部多巴胺神经元(dopamine，DA)的大量丢失,进一步导致纹状体内多巴胺含量降低^[1]。目前对于导致多巴胺神经元凋亡的机制仍未明确。因此，探索调控神经元凋亡的信号通路，并且在此基础上开发选择性的干预凋亡信号传递通路关键靶点的抗神经元凋亡药物具有重要意义。Tau蛋白在PD发病的发生发展进程中发挥重要的作用^[2]。而tau蛋白作为一种微管相关蛋白可被多种蛋白激酶磷酸化，其中对其磷酸化起重要作用的上游激酶是糖原合成激酶(GSK-3β)和周期依赖性蛋白激酶5(CDK5)^[3]。其中CDK5的激活主要依赖于p35,然而在病理状态下，p35水解为p25,p25同时具有促进GSK-3β激活的作用。在AD患者中进一步发现：p25的聚集可以促进tau蛋白的过度磷酸化以及神经元凋亡^[4]。我们筛选了一系列可能对多巴胺神经元具有保护作用的吲唑衍生物，发现一种单体化合物5-羟基-1-氢-吲唑对MPP⁺诱导凋亡的SH-SY5Y细胞具有明显的保护作用，并进一步探索了其可能的作用机制。

人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y购自于上海细胞所。

5-羟基-1-氢-吲唑(Fig 1)、MPP⁺、四氮唑盐(MTT)、Hoechst 33258均购自Sigma。5-羟基-1-氢-吲唑用DMSO溶解配成1 000×的储备液，MPP⁺用无血清的培养基配成100 mmol·L^-1储备液，两者均贮存于-20℃冰箱，备用。

Fig 1 Structure of 5-hydroxy-1H-indazole

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特异性酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxyase,TH)的rabbit多克隆抗体与特异性P-tau(Ser396)的goat多克隆抗体均购自Santa Cruz公司；P-GSK-3β(Ser9)购自Cell Signaling Techology公司；P-GSK-3β(Try216)购自BD公司。

CO₂组织培养箱(美国Forma Scientific公司)；倒置光学显微镜(日本Nikon公司)；酶标仪(BIO-RAD公司)；电泳仪(BIO-RAD公司)等。

SH-SY5Y细胞用含10%胎牛血清的Basic DMEM培养基培养，孵育在37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中，待细胞生长至适宜密度，胰蛋白酶消化传代。

SH-SY5Y细胞消化接种在96或24孔细胞培养板，待细胞贴壁后，加入不同浓度的MPP⁺和5-羟基-1-氢-吲唑，以MTT法^[5]探索MPP⁺的最适宜造模浓度，以及提前2h加入不同浓度的5-羟基-1-氢-吲唑对SH-SY5Y细胞的保护作用；以Hoechst 33258荧光核染^[6]观察5-羟基-1-氢-吲唑对凋亡细胞核形态学的影响；以免疫细胞化学染色法^[7]观察5-羟基-1-氢-吲唑对细胞内酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxyases,TH)含量的影响；以Western blot法^[8]检测磷酸化tau及其上游激酶：磷酸化糖原合成激酶(P-GSK-3β)与周期依赖性蛋白激酶5(CDK5)的表达与活性，免疫印迹条带运用ger-pro analyzer进行半定量分析，结果以相对光密度(relative opticaldensity,ROD)表示。

统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行，实验结果以x± s 表示，单因素间多组比较采用One-way ANOVA分析。

MPP⁺对SH-SY5Y细胞的毒性成浓度依赖性，MPP⁺在1 000 μmol·L^-1作用72 h后，与空白组细胞相比，其细胞存活率降至(53.58±0.81)%(P< 0.05)，其浓度增加，细胞存活率不再明显下降(Fig 2)。

Fig 2 MPP+ leaded SH-SY5Y cells death in a concentration-dependent manner SH-SY5Y cells were treated with various doses of MPP+ for 72 h. The cell viability was evaluated by using the MTT reduction assay. *P<0.05 vs control

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终浓度为0.1、1、10和100 μmol·L^-1的5-羟基-1-氢-吲唑提前2h加入培养基，1000 μmol·L^-1 MPP⁺继续作用72 h，细胞存活率与空白组相比分别为(81.29±0.96)%、(83.23±0.82)%、(80.16±0.73)%、(73.40±0.67)%，与MPP⁺组相比细胞存活率明显提高(P<0.01)(Fig 3A)。在无MPP⁺处理的情况下，5-羟基-1-氢-吲唑单独作用于SH-SY5Y神经细胞，与空白组相比，细胞存活率的改变没有统计学意义(P>0.05)(Fig 3B)。细胞内多巴胺神经元数目以酪氨酸羟化酶的ABC法进行检测，与空白组相比，MPP⁺引起多巴胺能神经元大量丢失，而0.1、1、10和100 μmol·L^-1 5-羟基-1-氢-吲唑预处理会明显抑制MPP⁺导致的多巴胺神经元数目的减少(Fig 3C)。

Fig 3 5-Hydroxy-1H-indazole attenuated MPP+-reduced cell viability A：Cells were pretreated with various concentrations of 5-hydroxy-1H-indazole for 2 h,and then treated with 1000 μmol·L-1 MPP+ for 72 h. MTT reduction assay was used to analyze the cell viability (*P<0.05 vs control; ##P<0.01 vs MPP+)； B：Cells were treated with various concentrations of 5-hydroxy-1H-indazole without MPP+； C：Immunocytochemistry staining of TH-positive cells, a: vehicle treated; b: MPP+ treated; c-f: pretreated with 0.1,1,10, and 100 μmol·L-1 5-hydroxy-1H-indazole respectively

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SH-SY5Y细胞内细胞核的凋亡情况应用Hoechst 33258染色法进行检测。正常细胞核呈现圆形，并且弥散均匀分布，而凋亡的细胞核呈现体积缩小、固缩、凝聚、浓染等特征。在溶剂对照组内，细胞核形态正常(Fig 4A)，在1 000 μmol·L^-1 MPP⁺处理72 h之后，细胞核呈现明显凋亡(白色箭头所示)(Fig 4B)，而1 μmol·L^-15-羟基-1-氢-吲唑预处理2 h之后，核凋亡明显减轻(Fig 4C)。

Fig 4 5-Hydroxy-1H-indazole inhibited MPP+-induced SH-SY5Y cell nuclear apoptosis SH-SY5Y cells were pretreated with 5-hydroxy-1H-indazole for 2 h,and then exposed to 1 000 μmol·L-1 MPP+ for 72 h for hoechst 33258 staining. A: vehicle treated; B: 1 000 μmol·L-1 MPP+ treated; C: pretreated with 1 μmol·L-1 5-hydroxy-1H-indazole.Typical apoptotic morphology was detected in b, but few in a and c (×200).

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Western blot结果显示MPP⁺可引起SH-SY5Y细胞内tau的异常磷酸化(P< 0.05)(Fig 5),GSK-3β蛋白激活以及CDK5的活性提高(P< 0.05)(Fig 6)，并且在MPP⁺处理8 h时达到高峰。

Fig 5 MPP+ induced hyperphosphorylation of tau (Ser396) Western blot assay was used to detect the level of P-tau(Ser396) by using the specific antibody in SH-SY5Y cells treated with 1 000 μmol·L-1 MPP+ for 0, 4, 8, 16, and 24 h. Data represented the x± s from three separate experiments. *P < 0.05 vs control group.

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Fig 6 Activities of GSK-3β and CDK5 were increased by MPP+ in SH-SY5Y cells SH-SY5Y cells were treated with 1000 μmol·L-1 MPP+ for 0, 4, 8, 16 and 24 h respectively. Western blot was used to detect the levels of P-GSK-3β(Ser9 and Tyr216) and p25 with the specific antibodies. Data represented the x± s from three separate experiments. *P<0.05 vs control group.

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Western blot的结果显示，1 μmol·L^-15-羟基-1-氢-吲唑预处理2h，MPP⁺继续作用8 h后与MPP⁺组比较，细胞内P-tau(Ser396)、P-GSK-3β(Tyr216)与p25的表达水平明显降低，P-GSK-3β(Ser9)表达水平明显增高(P< 0.01)(Fig 7)。

Fig 7 5-Hydroxy-1H-indazole reversed tau phosphorylation and decreased activities of GSK-3β and p25 induced by MPP+ SH-SY5Y cells were pretreated with 1 μmol·L-1 5-hydroxy-1H-indazole for 2 h ,then 1000 μmol·L-1 MPP+ for 8 h. Western blot was used to test the levels of tau phosphorylation , P-GSK-3β (Ser9 and Try216) and p25.Data represented the x± s from three separate experiments. *P<0.05 vs control; ##P<0.01 vs MPP+.

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PD是一种多发生在中、老年人中的一种慢性进行性神经系统退行性疾病，其主要临床表现为运动性障碍、静止性震颤、肌强直等，严重影响患者的生活质量。PD的症状和体征能够被提高多巴胺功能的药物缓解，其中最有效的是左旋多巴，但是左旋多巴出现的一系列副作用限制了它的广泛应用。更令人失望的是，如果长期使用，左旋多巴可能损害神经元，加速神经元的凋亡^[9]。因此迫切需要寻找能够有效控制PD病程的神经元保护性药物。

众所周知，细胞凋亡在PD的神经元退化过程中起着关键性作用，但是介导PD中黑质多巴胺神经元凋亡是多条信号传递通路共同作用的结果。其中部分已知的不同信号通路的交叉点“tau蛋白”，由于在PD的病理发展进程中扮演重要角色^[10]，引起了人们的关注。以往的研究已经证明，α-突触核蛋白的错误折叠和异常聚集是PD发病的一个关键环节，而tau蛋白和α-突触核蛋白之间存在密切关系。tau蛋白和α-突触核蛋白共同存在于路易氏体(LBs)内，在80%偶发性PD或路易体痴呆(DLB)患者的髓质中检测到tau-免疫反应的路易氏体(LBs)，其中tau蛋白往往定位于LBs的周边区域^[11]。光密度研究表明，在PD患者额叶皮层的突触富集区域有20％~40％的tau蛋白的Ser396位点磷酸化。临床中发现，PD患者脑脊液中的tau蛋白水平是升高的^[12]。已有研究报道,在PD患者尸检中发现tau蛋白的磷酸化水平明显提高。这些提示tau蛋白有望成为治疗AD,PD等神经退行性疾病的的理想靶点^[13]。在我们的研究中发现，MPP⁺可引起tau蛋白的异常磷酸化，并且在处理8h后达到高峰，而联合应用5-羟基-1-氢-吲唑，tau蛋白的磷酸化水平明显降低，这提示5-羟基-1-氢-吲唑的神经元保护作用可能与抑制tau蛋白的过磷酸化有关。

Tau蛋白可被多种蛋白激酶磷酸化，其中对其磷酸化起重要作用的上游激酶是GSK-3β和CDK5。以往研究也已证明，GSK-3β可作为防治PD的药物作用靶点^[14]。GSK-3β包含两个重要的位点即Ser9和Tyr216。P-GSK-3β(Ser9)抑制GSK-3β活性,P-GSK-3β(Tyr216)提高GSK-3β的活性^[15]。我们的研究发现：MPP⁺可降低P-GSK-3β(Ser9)水平，升高P-GSK-3β(Tyr216)水平，导致GSK-3β活化；而联合应用5-羟基-1-氢-吲唑可逆转这种现象，这提示5-羟基-1-氢-吲唑发挥神经元保护作用可能与抑制GSK-3β的活性有关。p25的聚集对于CDK5的活性变化具有重要作用，我们在研究中发现：MPP⁺可引起p25的聚集，而联合应用5-羟基-1-氢-吲唑，可降低p25的积累，进一步降低CDK5的水平。这提示5-羟基-1-氢-吲唑发挥神经元保护作用与抑制CDK5的活性有关。以上也提示我们，5-羟基-1-氢-吲唑的神经元保护作用可能与双重抑制对神经元凋亡起重要作用的关键激酶：GSK-3β和CDK5的活性有关，对控制PD的发生发展进程具有重要意义。

根据美国一个专利(US7629374B2,Use of Hydroxyindazole Derivatives for the Inhibition of Tau Phosphorylation)，我们选择一些结构类似物，从中筛选出一系列可能具有潜在抑制tau蛋白过磷酸化的吲唑衍生物，幸运地发现了5-羟基-1-氢-吲唑的神经元保护作用。在以往的研究中也发现，6-羟基-1-氢-吲唑通过抑制tau蛋白磷酸化发挥保护神经元的作用^[7]。那么在吲唑衍生物的母核中引入其他不同基团，是否同样具有抑制tau蛋白过磷酸化的作用呢？抑制作用增强还是降低呢？这也提示我们对于这一系列具有不同官能基团的化合物引起不同药效学的探索具有重要意义。

综上所述，5-羟基-1-氢-吲唑具有明显的神经元保护以及抗神经元凋亡作用，而这种保护作用是与神经元凋亡密切相关的GSK-3β—tau，CDK5—tau通路有关。然而，5-羟基-1-氢-吲唑在体内是否同样具有多巴胺能神经元保护作用呢？我们拟将5-羟基-1-氢-吲唑应用于MPTP PD小鼠模型中，观察其对PD动物模型形态学、生物化学以及行为学等方面的影响，为5-羟基-1-氢-吲唑成为有效控制PD病程的神经元保护药物提供实验依据。

(致谢:本研究是在南方医科大学药学院临床药理研究所，在饶进军，王文雅两位老师的悉心指导下，由徐圆圆、梁小凤、朱雯婷参与完成。在此诚挚感谢老师们以及同学们给与的帮助,使得实验得以顺利完成！)