2. 湖北科技学院临床医学院, 湖北 咸宁 437100
2. Clinical Medical College, Hubei University of Science and Technology, Xianning Hubei 437100, China
不育症是影响男女双方家庭的全球性问题，据估计我国的不育症发病率约在10％左右，其中男性所导致的不育者不少于不育夫妇的50％。大量的动物实验和临床研究表明，长期饮酒可以改变睾酮分泌以及精子发生，从而导致不育[1, 2, 3]。迄今为止，乙醇引起睾丸功能障碍的具体机制尚未阐明，但酒精代谢过程中产生的自由基以及引起的氧化反应已得到多数学者的认可。复方总黄酮由本实验室自行提制，主要成分是葛花和枳棋子，经体外实验证明其有良好抗氧化效果。本文拟通过制备慢性酒精睾丸损伤小鼠模型，探讨复方总黄酮对其的保护作用及其可能的作用机制，为探讨慢性酒精所致男性不育的发病机制及寻求有效的治疗药物提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物SPF级♂ C57BL/6小鼠，由武汉大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(鄂)2008-0004。小鼠适应性喂养在恒温(23±2) ℃、湿度50%～60%、人工照明明暗各12 h的饲养室内，标准饲料和自来水自行取用。
1.1.2 药品与试剂复方总黄酮(主要成分葛花、枳棋子等，由本实验室自行提炼)；红星二锅头白酒(60％,北京红星股份有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒购自南京建成生物研究所；小鼠睾酮酶联免疫检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所；其他均为市售分析纯。
1.1.3 主要仪器低温超速离心机(Scan Speed公司)，分析天平(Sartorius公司)，多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)，显微镜(OLYMPUS公司)。
1.2 方法 1.2.1 实验分组及给药方法100只SPF级C57BL/6 ♂小鼠随机分为5组，分别为：① 正常对照组：以蒸馏水为饮水源；② 慢性酒精组：以白酒为唯一饮水源。给予酒精浓度分别为10％ (第1～4周)、14％ (第5～8周)、18％(第8～12周)、22％(第13周～6个月) 的红星二锅头酒；③ 酒精+低剂量药物组：慢性酒精摄入小鼠给予10 g·kg-1·d-1复方总黄酮进行灌胃；④ 酒精+高剂量药物组：慢性酒精摄入小鼠给予20 g·kg-1·d-1复方总黄酮进行灌胃；⑤ 药物对照组：正常小鼠给予20 g·kg-1·d-1复方总黄酮进行灌胃。
1.2.2 指标测定 1.2.2.1 生化测定采用ELISA试剂盒测定睾丸组织中睾酮含量，生化检测试剂盒测定睾丸组织中蛋白含量、SOD活力和MDA含量。
1.2.2.2 病理学检测取睾丸部分组织，用4％多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察睾丸的形态结构。
1.2.2.3 超微结构检测取米粒大小睾丸组织，2.5％戊二醛和1％饿酸双重固定，丙酮脱水，Epon812包埋，铅铀染色，透射电镜观察。
1.3 统计学方法所有数据以x±s表示，用SPSS 11.5统计学软件进行分析，行One-Way ANOVA检验。
2 结果 2.1 睾丸组织中生化指标以及睾酮的变化Tab1结果显示，慢性酒精组SOD活力明显降低，而MDA含量明显升高，与正常对照组比较差异具有统计学意义(P < 0.05)；此外，睾丸组织中睾酮的含量也出现明显下降(P < 0.05)，而复方总黄酮可升高SOD活力和睾酮含量，同时降低MDA含量，具有良好的剂量依赖性(P < 0.05)。
| Group | SOD/kU·g -1 Pro | MDA/μmol·g -1 Pro | Testosterone/nmol·L -1 |
| Normal control | 46.1±12.1 | 2.12±0.75 | 10.95±1.23 |
| Chronic alcohol | 29.0±7.6 * | 3.67±1.05 * | 8.78±1.06 * |
| Alcohol+low dose drug | 39.2±11.7 | 2.72±0.85 | 10.65±1.64 # |
| Alcohol+high dose drug | 46.2±15.8 # | 1.94±0.55 # | 10.64±0.85 # |
| Drug control | 47.3±11.9 | 2.08±0.59 | 10.65±0.64 |
| * P < 0.05 vs normal control； # P < 0.05 vs chronic alcohol | |||
正常对照组小鼠睾丸组织中生精细胞与支持细胞在管腔内有序排列，且精原细胞规则地紧贴于生精小管的基膜，向内依次为初级精母细胞、精子细胞、精子；慢性酒精组可见生精上皮有不同程度的损伤，生精周期分期不清，精子发生多停止在初级精母细胞或精子细胞阶段，管腔内无精子，可见大量生精细胞脱落；睾丸间质细胞变性、坏死，数量减少；复方总黄酮治疗组生精小管损伤程度明显轻于慢性酒精组，尤其是大剂量治疗组生精小管结构接近正常，见Fig1。
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| Fig.1 Influence of compound flavones on testicular histomorphology in chronic alcohol mice A:Normal control; B:Chronic alcohol; C:Alcohol+low dose drug; D:Alcohol+high dose drug; E:Drug control |
正常对照组生精小管固有膜结构完整，睾丸生精上皮内处于不同周期的生精细胞有序排列，支持细胞结构正常，生精细胞胞间桥和支持细胞连接复合体完整，线粒体丰富。慢性酒精组可见细胞内溶酶体增加，支持细胞滑面内质网出现变性退化，胞质空泡样变常见，支持细胞间连接复合体断裂，生精上皮排列紊乱。而复方总黄酮治疗组睾丸损伤明显减轻，尤其是大剂量治疗组生精上皮超微结构接近正常，见Fig2。
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| Fig.2 Influence of compound flavones on ultrastructure changes in chronic alcohol mice A:Normal control; B:Chronic alcohol; C:Alcohol+low dose drug; D:Alcohol+high dose drug; E:Drug control |
早在1997年Villalta等[4]对无症状慢性酒精中毒男性的精液进行分析，发现长期酗酒男性精子数量减少、精子活动率下降以及精子畸形增多。此后Muthusami等[5]进一步研究发现，慢性饮酒将影响男子激素水平和精子质量，严重者可致不育。这些研究结果表明酒精可明显影响精子的质量和数量，而决定精子质量改变的独立因素是乙醇的摄入量。
氧化应激在酒精所致的睾丸损伤中扮演着重要角色。酒精及其代谢物乙醛可以在体内产生自由基，自由基易攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，从而诱发脂质过氧化，睾丸中的线粒体膜和精子均富含不饱和脂肪酸，容易受过氧化攻击产生活性氧，进而影响精子功能[6]。SOD作为体内抗氧化的主要酶之一，MDA作为脂质过氧化反应的终产物，可反映组织细胞膜损伤受自由基攻击的程度。本实验结果表明，慢性酒精摄入小鼠与正常对照组比较MDA明显升高，而SOD活力下降，提示睾丸清除氧自由基能力下降，氧化损伤发生。研究发现，具有抗氧化活性的药物如门冬氨酸鸟氨酸[7]、杏子[8]等均可通过提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性，而有效防止乙醇诱导的大鼠睾丸损伤。
睾丸的功能除生成精子外，还有一种重要的功能就是合成并分泌雄激素(主要是睾酮)。睾酮由睾丸间质细胞分泌，睾丸组织内睾酮浓度远高于外周血清睾酮浓度，其浓度变化比后者能更好地反映睾丸的睾酮合成功能，而且睾丸组织内睾酮直接参与精子发生[9]。本实验结果显示，慢性酒精摄入小鼠睾丸中睾酮水平明显低于正常对照组，表明其睾酮合成明显减少，提示慢性乙醇中毒可能对睾丸功能有一定的损害。
葛花作为传统的解酒药物，我们前期研究发现，葛花提取物可通过抑制氧化应激水平从而对糖尿病心肌病产生保护作用[10]。王金凤等[11]研究发现，葛花总黄酮通过其抗氧化作用以及下调心肌β-ARK1mRNA的表达，抑制小鼠急性心肌缺血损伤。此外，复方枳棋子制剂可通过增加小鼠肝组织中乙醇代谢酶活性，从而产生较好的解酒及中枢保护作用[12]。本实验室通过在葛花提取物的基础上加入枳棋子解酒成分，旨在提高复方总黄酮的抗氧化和解酒作用。本研究结果显示，复方总黄酮不仅可减轻慢性酒精摄入小鼠睾丸生精小管的损伤，同时可提高抗氧化能力以及睾酮的合成。
综上所述，酒精作为睾丸的一种毒物，可使睾丸生精小管损伤，生精细胞退化，并使睾丸间质细胞变性、坏死，睾酮合成减少。复方总黄酮通过抑制氧化应激水平、提高睾丸中睾酮含量，从而对慢性酒精所致的小鼠睾丸损伤具有保护作用。
| [1] | La Vignera S, Condorelli R A, Balercia G, et al. Does alcohol have any effect on male reproductive function? A review of literature[J]. Asian J Androl,2013,15(2):221-5. |
| [2] | Giannessi F,Scavuzzo M C,Giambelluca M A,et al. Chronic alcohol administration causes expression of calprotectin and RAGE altering the distribution of zinc ions in mouse testis[J]. Syst Biol Reprod Med, 2015, 61(1):18-25. |
| [3] | Condorelli R A,Calogero A E,Vicari E, et al. Chronic consumption of alcohol and sperm parameters:our experience and the main evidences[J]. Andrologia, 2015, 47(4):368-79. |
| [4] | Villalta J,Ballescà J L,Nicolás J M, et al. Testicular function in asymptomatic chronic alcoholics:relation to ethanol intake[J]. Alcohol Clin Exp Res, 1997, 21(1):128-33. |
| [5] | Muthusami K R,Chinnaswamy P. Effect of chronic alcoholism on male fertility hormones and semen quality[J]. Fertil Steril, 2005, 84(4):919-24. |
| [6] | Koksal I T,Usta M,Orhan I,et al. Potential role of reactive oxygen species on testicular pathology associated with infertility[J]. Asian J Androl,2003,5(2):95-9. |
| [7] | Mailankot M,Jayalekshmi H,Chakrabarti A, Vasudevan D M. Effect of exogenous L-ornithine L-aspartate on ethanol induced testicular injury in Wistar rats[J]. Indian J Clin Biochem,2009, 24(1):94-7. |
| [8] | Kurus M,Ugras M,Ates B, Otlu A. Apricot ameliorates alcohol induced testicular damage in rat model[J]. Food Chem Toxicol,2009,47(10):2666-72. |
| [9] | Zheng Y Q, Zhang X B, Zhou J Q, et al. The effects of artery-ligating and artery-preserving varicocelectomy on the ipsilateral testes in rats[J]. Urology, 2008,72(5):1179-84. |
| [10] | Yu W,Zha W,Guo S,et al. Flos Puerariae extract prevents myocardial apoptosis via attenuation oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic mice[J]. PLoS One,2014,9(5):e98044. |
| [11] | 王金凤, 薄华本, 孟祥颖, 等. 葛花异黄酮对急性心肌梗死小鼠心肌的保护作用[J]. 中国药理学通报, 2010,26(1):59-62. Wang J F, Bo H B, Meng X Y, et al. The protection of isotlavones on myocardium in myocardial infarction mouse[J]. Chin Pharmacol Bull, 2010, 26(1):59-62. |
| [12] | 宋莎莎,路景涛,袁平凡,等. 复方枳棋子制剂对小鼠酒精中毒的解救作用[J]. 中国新药杂志,2013,22(21):2524-8. Song S S, Lu J T, Yuan P F, et al. Detoxication effect of compound preparation of Hovenia dulcis Thunb in mice with alcoholism[J]. Chin J New Drug, 2013, 22(21):2524-8. |