2. 广州中医药大学中药学院, 广东 广州 510006
2. School of Chinese Herbal Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China
胃肠黏膜损伤修复包括细胞迁移、分化、增殖等过程，其中细胞迁移是其重要步骤，尤其在早期整复阶段[1]。益气健脾中药能促进胃肠黏膜损伤修复[2]，但其作用机制尚不清楚。本课题组近年在小肠上皮(IEC-6)细胞的研究发现，益气健脾中药黄芪、白术、党参、甘草的提取物能促进细胞迁移，作用机制与其影响多胺介导钾通道激活信号通路有关[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11]，其中对党参糖提取物(下文图表中简称CSE)、甘草糖提取物(下文图表中简称GSE)的研究表明，二者均可促进IEC-6细胞迁移，逆转DFMO(多胺合成抑制剂)所致的细胞迁移抑制，提高细胞迁移过程细胞内多胺(精脒)含量，逆转DFMO所致的精脒含量降低[5, 6]；提示其促进细胞迁移的作用与增加细胞内多胺含量有关，为进一步探讨党参、甘草糖提取物促进细胞迁移的作用机制，本文观察其对多胺介导钾通道激活信号通路相关指标的影响，为党参、甘草胃肠黏膜损伤修复作用机制研究提供参考。
1 材料 1.1 药材党参药材为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf的干燥根；甘草药材为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)的干燥根及根茎，由广州中医药大学中药鉴定教研室童家赟讲师鉴定。
1.2 试剂高糖DMEM(Cat.No.12800-017)、胎牛血清(Cat.No.10099-141)、青-链霉素(Cat.No.15140-122)，均为Gibco公司产品。精脒(spermidine，SPD，Cas.No.124-20-9，Cat.No.85558，分子质量145.25)、二氟甲基鸟氨酸(α-difluoromethylornithine，DFMO，Cas.No.96020-91-6，Cat.No.288500-25MG，分子量236.7)，美国Calbiochem公司产品；胰酶(1 ∶250，Cas.No.9002-07-7，Cat.No.0458-250G)，美国Amresco公司产品；蛋白提取试剂盒(Cat.No.269-500)，美国Biovion公司产品；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Cat.No.BP312)，南京碧波生物科技有限公司产品；Kv1.1一抗为多克隆兔抗(Cat.No.ab32433)，RhoA一抗为多克隆兔抗(Cat.No.ab68826)，均为英国Abcam公司产品；GAPDH一抗为多克隆兔抗(Cat. No.10494-1-AP)，美国Proteintech公司产品；HRP标记羊抗兔二抗(Cat.No.EO30120-01)，美国EarthOx公司产品；ECL高灵敏度化学发光检测试剂盒(Cat.No.CW0049)，北京康为世纪生物科技有限公司产品；牛血清白蛋白(Cat. No.738323)，Roche公司产品；脱脂奶粉(Cat.No.Q/NYLB 0039S)，伊利公司产品；膜电位荧光探针DiBAC4(3)(Cat.No.61011，Lot.No.10D0819)，美国Biotium公司产品。
1.3 仪器Smart specphus核酸蛋白测定仪，iMark酶标仪，ChemiDoc XRS化学发光成像系统，均为美国Bio-Rad公司产品；FACSCalibur型流式细胞仪，美国BD公司产品；SP2型激光共聚焦显微镜，德国Leica公司产品；激光共聚焦显微镜专用玻底培养皿(35 mm×12 mm)，丹麦NUNC公司产品；3111型CO2培养箱，美国Thermo Scientific公司产品；AUW120D型分析天平，日本岛津公司产品。
1.4 细胞IEC-6细胞(大鼠小肠隐窝上皮细胞)，购自ATCC(American Type Culture Collection)，Catalog No.CRL-1592，Lot.4988325。
2 方法 2.1 党参和甘草糖提取物制备党参、甘草糖提取物制备：称取党参或甘草饮片200 g，石油醚回流提取1 h。药渣挥干溶剂后，用体积分数为0.80的乙醇回流提取2次，每次1 h；药渣再用蒸馏水回流提取2次，每次1 h，合并2次水提液，减压浓缩至浓度为含药材0.5 kg·L-1；浓缩液加无水乙醇至乙醇体积分数为0.80，4℃静置过夜，以布氏漏斗加滤纸抽滤，去上清液，沉淀物加水溶解，再加无水乙醇使乙醇体积分数为0.80后，沉淀过夜，重复3次；所得沉淀物加纯水溶解成水溶液，以Sevage试剂(氯仿 ∶正丁醇=5 ∶1)萃取，取上层水相过大孔树脂，以蒸馏水洗脱，直至收集的洗脱液与5倍量体积分数为0.95的乙醇混合不产生浑浊，洗脱液加无水乙醇至乙醇体积分数为0.80，所得沉淀物分别用体积分数为0.95的乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥，4℃保存。使用时加PBS配制成5 g·L-1党参或甘草糖提取物溶液，0.22 μm滤膜过滤。苯酚-硫酸法以分光光度计测得党参、甘草糖提取物平均含量(以葡萄糖计)分别为41.0%和49.3%。
2.2 Western blot法检测Kv1.1、RhoA蛋白表达细胞培养及给药方法：细胞以4×108·L-1，每孔2 mL接种于6孔板，DMEM培养液含10%胎牛血清(FBS)、10 mg·L-1胰岛素、100 kU·L-1青霉素-链霉素，5%CO2，95%空气，饱和湿度下37℃培养24 h，用刻刀沿6孔板底部中央轻轻划一直线划痕，迅速加入受试药(党参、甘草糖提取物终浓度为50、100 mg·L-1)及完全培养基每孔2.5 mL；DFMO负荷实验则在加受试药(党参、甘草糖提取物终浓度为100、200 mg·L-1)同时加入DFMO 2.5 mmol·L-1，在5%CO2，95%空气，饱和湿度下37℃培养24 h。
总蛋白提取及测定：细胞培养24 h后，吸弃培养液，PBS冲洗细胞表面2次，加适量PBS，细胞刮刀轻轻将细胞从壁上完全刮下，将含有细胞的PBS液收集到5mL离心管，离心后收集细胞，提取总蛋白。总蛋白少量用于蛋白浓度测定，其余予5×蛋白上样缓冲液以4 ∶1比例混匀，100℃水浴煮沸5 min使蛋白变性，置冰上5 min，然后10 000 r·min-1离心1 min，-20℃分装保存。蛋白浓度测定按BCA试剂盒说明书操作。
Western blot法操作：蛋白上样量为每孔20 μg，SDS-PAGE凝胶电泳(起始电压60 V，条带到达分离胶后调至120 V)，蛋白转移至PVDF膜(转膜电流300 mA，时间1 h)。PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭，分别用一抗Kv1.1、RhoA(均1 ∶1 000稀释)孵育过夜，洗膜，二抗(1 ∶10 000稀释)孵育2 h，洗膜，ECL法显色；X线片曝光条带并显影定影，化学发光成像仪Image J图像处理软件画图工具圈起条带，所得mean值即各条带的平均灰度值。比较各组Kv1.1/GAPDH或RhoA/GAPDH平均灰度比值。
2.3 流式细胞仪检测细胞膜电位(Em)[12]细胞培养及给药方法：细胞生长至80%~90%，消化细胞制作单细胞悬液；以4×108·L-1，每孔2 mL接种于6孔板，37℃、5%CO2，饱和湿度培养24 h，用1 mL移液器吸头在6孔板底部中央轻轻划一个“十”字划痕，PBS冲洗细胞表面3次，迅速加入受试药(党参、甘草糖提取物终浓度为50、100 mg·L-1)及完全培养基每孔2.5 mL；DFMO负荷实验则在加受试药(党参、甘草糖提取物终浓度为100、200 mg·L-1)同时加入DFMO 2.5 mmol·L-1，每组3个复孔，37℃、5%CO2，饱和湿度下培养。
细胞悬液制备及荧光标记：加入受试药后培养12 h，HBSS(D-Hanks缓冲液)冲洗细胞2次，加入胰酶消化，细胞回缩变圆后，加等量DMEM终止消化；3 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加入HBSS重悬；再离心，弃上清液，每个离心管(6孔板每孔细胞收集于1个离心管)加入含1 μmol·L-1 DiBAC4(3)溶液的HBSS 1 mL。CO2培养箱中避光孵育8 min，此过程每2 min摇晃混匀1次，使染料与细胞充分结合。孵育完毕，3 000 r·min-1离心5 min；弃上清液，加入适量HBSS重悬，离心，转入流式管，上流式细胞仪检测；激发波长488 nm，发射波长520 nm，每管检测10 000个细胞，同时设不标记的空白细胞管用于调零。比较各组的平均荧光强度(mean值)进行统计。
DiBAC4(3)是细胞膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料，根据其在细胞内外的重新分布，可无损伤地测定细胞膜电位的变化。DiBAC4(3)本身无荧光，当进入细胞与胞质内的蛋白质结合后发出荧光。DiBAC4(3)进入细胞内增多，荧光增强时，表明膜电位负值减小，膜去极化；反之，细胞内荧光强度降低则表示细胞膜超极化。
2.4 激光共聚焦显微镜检测细胞Ca2+水平[13]细胞培养及给药方法：细胞生长至80%~90%，消化细胞制作单细胞悬液；以4×108·L-1，每孔2 mL接种于激光共聚焦培养皿中，37℃、5%CO2，饱和湿度下培养24 h，用1 mL移液器吸头沿底部中央轻轻划一直线划痕，PBS冲洗细胞表面3次，迅速加入受试药(党参、甘草糖提取物终浓度为50、100 mg·L-1)及完全培养基每孔2.5 mL；DFMO负荷实验则在加受试药(党参、甘草糖提取物终浓度为100、200 mg·L-1)同时加入DFMO 2.5 mmol·L-1；每组2个复孔，37℃、5%CO2，饱和湿度下培养。
荧光物质孵育：各组加入受试药培养12 h，HBSS冲洗2次，每个培养皿加入终浓度为5 μmol·L-1的Fluo-3/AM探针装载液1 mL，CO2培养箱中避光孵育30 min，吸弃探针装载液，HBSS冲洗细胞3次，加入适量HBSS，CO2培养箱中避光孵育20 min。激光共聚焦显微镜下放大200倍进行荧光图片采集，每个培养皿选择划痕附近迁移细胞6个视野采集荧光图片。
平均荧光强度计算：IPP软件将图片转成灰度图片，测量累积光密度值(IOD)与area。每张图片的IOD即为其总荧光强度，再以显微镜数出每张图片的细胞个数；IOD除以细胞总数，即为单张图片每个细胞的平均荧光强度值。
2.5 统计学方法数据用x±s表示，SPSS 17.0统计软件对各组进行单因素方差分析。组间比较，方差齐者，用LSD检验；方差不齐者，用Dunnett T3检验。
3 结果 3.1 党参、甘草糖提取物对Kv1.1蛋白表达的影响 3.1.1 对Kv1.1蛋白表达的影响(无DFMO负荷)Fig1蛋白条带灰度值比较，党参糖提取物(50 mg·L-1和100 mg·L-1)与空白组比较均P < 0.01；甘草糖提取物50 mg·L-1组与空白组比较P < 0.01，甘草糖提取物100 mg·L-1组与空白组比较P < 0.05；表明党参、甘草糖提取物能提高细胞迁移过程钾通道蛋白Kv1.1蛋白表达。
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| Fig.1 Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts on kv1.1 expression(n=3) 1：CSE100 mg·L-1；2： CSE 50 mg·L-1；3：Control；4：spermindine 5 μmol·L-1；5： GSE 50 mg·L-1；6： GSE 100 mg·L-1 |
Fig2蛋白条带结果可见，DFMO能抑制Kv1.1蛋白表达，党参、甘草糖提取物(100 mg·L-1或200 mg·L-1)能改善DFMO所致Kv1.1蛋白表达抑制。
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| Fig.2 Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts on kv1.1 with DFMO(n=2) 1：DFMO+CSE 200 mg·L-1；2： DFMO+ CSE 100 mg·L-1；3：Control；4：DFMO 2.5 mmol·L-1；5：DFMO+spermidine 5 μmol·L-1；6： DFMO+GSE 100 mg·L-1；7： DFMO+GSE 200 mg·L-1 |
Fig3和Tab1结果显示，党参、甘草糖提取物组(50 mg·L-1)细胞的平均荧光强度低于空白组(P < 0.01)，表明其细胞膜超极化水平高于空白组，Em增加。表明党参、甘草糖提取物可增加细胞膜超极化水平，提高细胞膜电位。
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| Fig.3 Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts on Em A:Control; B:Spermidine 5 μmol·L-1;C:CSE 50 mg·L-1;D:CSE 100 mg·L-1;E:GSE 50 mg·L-1;F:GSE 100 mg·L-1 |
| Group | Dose | Mean |
| Control | - | 371.1±69.9 |
| Spermidine | 5 μmol·L -1 | 260.0±34.3 ** |
| CSE | 50 mg·L -1 | 228.9±16.4 ** |
| CSE | 100 mg·L -1 | 316.2±50.7 |
| GSE | 50 mg·L -1 | 180.9±24.3 ** |
| GSE | 100 mg·L -1 | 340.0±41.9 |
| ** P < 0.01 vs control | ||
Tab2结果显示，DFMO模型组细胞平均荧光强度高于空白组(P < 0.05)，表明DFMO组细胞膜去极化水平高于空白组，Em降低；党参、甘草糖提取物(100 mg·L-1或200 mg·L-1)能逆转DFMO所致细胞膜去极化(与模型组比较P < 0.05或P < 0.01)。
| Group | Dose | Mean |
| Control | - | 251.9±22.5 |
| DFMO | 2.5 mmol·L -1 | 301.5±16.9 * |
| Spermidine+DFMO | 5 μmol·L -1+2.5 mmol·L -1 | 221.6±15.4 △△ |
| CSE+DFMO | 100 mg·L -1+2.5 mmol·L -1 | 193.3±28.1 △△ |
| CSE+DFMO | 200 mg·L -1+2.5 mmol·L -1 | 266.2±29.2 |
| GSE+DFMO | 100 mg·L -1+2.5 mmol·L -1 | 243.3±22.9 △△ |
| GSE+DFMO | 200 mg·L -1+2.5 mmol·L -1 | 259.2±20.8 △ |
| *P < 0.05 vs control； ΔP < 0.05， ΔΔP < 0.01 vs DFMO | ||
Fig4和Tab3结果显示，党参、甘草糖提取物(50 mg·L-1或100 mg·L-1)能提高细胞迁移过程细胞Ca2+水平(与空白组比较P < 0.01)。
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| Fig.4 Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts on [Ca2+]cyt(200×) A:Control; B:Spermidine 5 μmol·L-1;C:CSE 50 mg·L-1;D:CSE 100 mg·L-1;E:GSE 50 mg·L-1;F:GSE 100 mg·L-1 |
| Group | Dose | Mean |
| Control | - | 79 329±15 995 |
| Spermidine | 5 μmol·L -1 | 102 540±13 323 ** |
| CSE | 50 mg·L -1 | 98 149±8 488 ** |
| CSE | 100 mg·L -1 | 106 090±15 099 ** |
| GSE | 50 mg·L -1 | 99 829±10 696 ** |
| GSE | 100 mg·L -1 | 96 963±10 158 ** |
| ** P < 0.01 vs control | ||
Tab4结果显示，DFMO负荷时，细胞Ca2+水平降低(模型组与空白组比较P < 0.01)；党参糖提取物(100 mg·L-1或200 mg·L-1)能逆转DFMO所致Ca2+水平降低(与模型组比较P < 0.01)。
| Group | Dose | Mean |
| Control | - | 52 548±4 775 |
| DFMO | 2.5 mmol·L -1 | 22 903±9 419 ** |
| Spermidine+DFMO | 5 μmol·L -1+2.5 mmol·L -1 | 48 757±10 634 △△ |
| CSE+DFMO | 100 mg·L -1+2.5 mmol·L -1 | 49 594±4 837 △△ |
| CSE+DFMO | 200 mg·L -1+2.5 mmol·L -1 | 35 455±10 032 △△ |
| GSE+DFMO | 100 mg·L -1+2.5 mmol·L -1 | 15 577±7 496 |
| GSE+DFMO | 200 mg·L -1+2.5 mmol·L -1 | 27 146±6 120 |
| ** P < 0.01 vs control； △△P < 0.01 vs DFMO | ||
Fig5蛋白条带灰度值比较，党参、甘草糖提取物(50 mg·L-1和100 mg·L-1)与空白组比较均P < 0.01；表明党参、甘草糖提取物能提高细胞迁移过程RhoA蛋白表达。
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| Fig.5 Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts on RhoA(n=3) 1： CSE 100 mg·L-1；2： CSE 50 mg·L-1；3：Control；4： Spermindine 5 μmol·L-1；5： GSE 50 mg·L-1；6： GSE 100 mg·L-1 |
Fig6蛋白条带结果可见，DFMO能抑制RhoA蛋白表达，党参、甘草糖提取物(100 mg·L-1或200 mg·L-1)能改善DFMO所致RhoA蛋白表达降低。
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| Fig.6 Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts on RhoA with DFMO (n=2) 1：DFMO+CSE 200 mg·L-1；2： DFMO+CSE 100 mg·L-1；3： Control；4：DFMO 2.5 mmol·L-1；5： DFMO+spermidine 5 μmol·L-1；6：DFMO+GSE 100 mg·L-1；7： DFMO+GSE 200 mg·L-1 |
党参性味甘平，归脾、肺经；功能健脾益肺，养血生津；用于脾肺气虚，食少倦怠，咳嗽虚喘，气血不足，足，面色萎黄，心悸气短，津伤口渴，内热消渴。甘草性味甘平，归心、肺、脾、胃经，功能补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药；用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢痉急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性[14]。党参、甘草是益气健脾著名方剂四君子汤的组成药物，临床和实验研究表明，四君子汤有促进胃肠黏膜损伤修复的作用[15]。
小肠上皮损伤后整复阶段，多胺增加则增强了钾通道蛋白的表达，K+外流，导致细胞膜超极化，增强了Ca2+内流驱动力而提高了细胞内Ca2+水平，后者增加了RhoA活性，使Rho-kinase激活，增加了肌球蛋白轻链磷酸化，从而刺激了应力纤维形成和细胞迁移；相反，消除了细胞内多胺(加入DFMO)，则下调了钾通道活性，减少了细胞内Ca2+，使RhoA/Rho-kinse信号通路不激活，减少了肌球蛋白轻链磷酸化，从而抑制了细胞迁移[1]。二氟甲基鸟氨酸(DFMO)是多胺合成的限速酶——鸟氨酸脱羧酶的特异性抑制剂，本课题组前期研究表明，党参、甘草糖提取物可促进小肠上皮(IEC-6)细胞迁移，逆转DFMO所致的细胞迁移抑制，提高细胞迁移过程多胺(精脒)含量，逆转DFMO所致的精脒含量降低[5, 6]。本文在此基础上，观察党参糖提取物、甘草糖提取物对IEC-6细胞迁移多胺介导钾通道激活信号通路的影响。结果显示二者在细胞迁移过程可以：提高钾通道蛋白Kv1.1蛋白表达水平，改善DFMO所致Kv1.1蛋白表达下降；提高细胞膜电位超极化水平，逆转DFMO所致细胞膜电位去极化；提高细胞内Ca2+水平，其中党参糖提取物能逆转DFMO所致Ca2+水平降低；提高Ca2+下游指标RhoA蛋白表达水平，改善DFMO所致RhoA蛋白表达降低。本课题组的另一研究表明，党参、甘草糖提取物可逆转钾通道抑制剂4-氨基吡啶(4-AP)所致的细胞迁移抑制及细胞膜去极化[16, 17]。结合前期党参、甘草糖提取物在IEC-6细胞的实验结果[5, 6]，表明其促进IEC-6细胞迁移的作用机制，与其影响多胺介导钾通道激活信号通路有关；此研究结果也与本课题组在益气健脾中药黄芪、白术、党参、甘草提取物的作用类似[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11]。提示对细胞迁移多胺介导钾通道激活信号通路的影响，可能是益气健脾中药促进胃肠黏膜损伤修复的作用机制之一。
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