星形胶质细胞活化是中枢神经系统损伤后最重要的表型之一，这些活化的细胞虽然能通过释放神经营养因子，有利于神经损伤的修复，但同时促进胶质瘢痕的形成。胶质瘢痕是轴突再生的主要物理屏障，并分泌大量细胞毒因子、炎症因子、补体蛋白而损害神经元^[1]。因此，采取有效的方式抑制脑损伤后星形胶质细胞过度活化，对于促进脑损伤后恢复有重要意义。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种跨膜蛋白，在中枢神经系统损伤(外伤、中风、肿瘤)或神经系统变性(阿尔茨海默病、帕金森病)等情况下，EGFR表达迅速上调，经免疫组织化学染色分析，EGFR阳性细胞大多是反应性星形胶质细胞，并长时间持续存在^[2]。此外，我们的前期研究表明，EGFR抑制剂染料木黄酮可阻滞大鼠星形胶质细胞活化^[3]。这些研究提示，EGFR可能在触发星形胶质细胞由静息状态转变为活化状态中起关键作用。然而，EGFR调控星形胶质细胞活化的分子机制仍不清楚。为此，本研究首先分析EGFR在脑出血后不同时期血肿周围脑组织中的表达特征，然后以EGFR siRNA转染大鼠星形胶质细胞，探讨EGFR基因沉默对细胞神经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、信号传导蛋白和转录激活物3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)、磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3)表达的影响。

出生后24 h以内的新生Wistar大鼠[SPF级，合格证号：SYKK(湘)2010-0006]购于南华大学实验动物学部。免疫组化SABC试剂盒(批号：SA1020)系武汉博士德公司产品。新生胎牛血清和DMEM培养基(批号：8114057)购于Gibco公司。睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)购于北京盛科博源生物公司(批号：22582)。TRIzol试剂(批号：10606ES60)、PVDF膜(批号：21457)由美国Invitrogen公司提供。逆转录试剂盒(批号：TB099)、PCR扩增试剂盒(批号：SK2491-50)分别购于美国Promega公司、上海生工生物工程公司。兔抗人EGFR(批号：sc-3784)、β-actin(批号：sc-1618)单克隆抗体以及兔抗大鼠GFAP(批号：sc-21364)、STAT3(批号：sc-9132)、p-STAT3(批号：sc-8059)、EGFR(批号：sc-3782)、β-actin(批号：sc-1616)单克隆抗体和山羊抗兔 IgG(批号：sc-33106)购自美国Santa Cruz 公司。

选择南华大学附属第一医院神经外科2011年1月至2014年12月行开颅经颞叶入路血肿清除手术治疗的80例基底节脑出血患者为研究对象，均经CT或者MRI确诊，根据标本取出距离脑出血时间分为4组：<1 d组、1~5 d组、6~10 d组及>10 d组，每组20例。在<1 d组中，男12例，女8例，年龄49~72岁，平均(62.17±10.65)岁，出血量40~81 mL，平均(59.37±11.85) mL；1~5 d组中，男11例，女9例，年龄53~76岁，平均(64.55±11.38)岁，出血量45~80 mL，平均(61.49±12.36) mL；6~10 d组中，男9例，女11例，年龄52~75岁，平均(63.18±12.54)岁，出血量42~83 mL，平均(60.59±10.33) mL；>10 d组，男13例，女7例，年龄54~78岁，平均(64.26±13.88)岁，出血量44~79 mL，平均(62.11±11.54) mL。每个病例于手术过程中取少量距血肿包膜1cm左右脑组织作为实验标本。同时，手术中将部分患者皮层“造瘘”起始处(血肿远隔部位)掉落的组织块作为对照组标本，共20例，其中男12例，女性8例，年龄52~78岁，平均(63.75±13.04)岁，出血量43~80 mL，平均(61.75±11.87) mL。各组性别、年龄及出血量等方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本实验经南华大学附属第一医院伦理委员会批准，而且家属均签署知情同意书。

取脑组织标本，10%中性甲醛固定后，石蜡包理，5 μm连续切片，采用免疫组化SABC法检测各组脑组织中EGFR表达，严格按照试剂盒说明书由专人进行统一操作，用PBS代替一抗作为空白对照。在PIPS-2020图像分析仪(重庆天海公司)上，每个切片随机取5个高倍视野,测定一定面积内阳性信号面积和阳性信号平均灰度值，计算阳性信号指数，作为EGFR表达水平。阳性信号指数/%=阳性信号面积×阳性信号平均灰度值/测定面积×100%。

取出生后24 h以内的新生Wistar大鼠10只，消毒固定，用断头法取其头部，取出大脑，剥去软脑膜后，分离出大脑皮层组织。将大脑皮层剪碎，用 0.125%的胰酶消化30 min，加入新生胎牛血清终止消化，1 000 r·min^-1离心5 min，将上层含酶液小心吸出，加入DMEM培养液，100目不锈钢筛网过滤，再加入适量新生胎牛血清，调整细胞悬液的密度至(3~5)×10⁸·L^-1，种植于培养瓶内，在37℃、5% CO₂条件下培养，每隔3~4 d换培养液1次，当细胞生长成致密单层后，进行传代培养，即得到纯化的星形胶质细胞。

取处于对数生长期的星形胶质细胞，接种于涂有多聚赖氨酸盖玻片的24孔板，加入DMEM培养液后，进行EGFR siRNA转染实验。将4 μL的Lipofectamine^TM RNAiMAX 与5 μL 20 μmol·L^-1 siRNA分别加入100 μL Opti-MEM中，静置 5 min后，将上述两种溶液混合，再静置20 min，随后把混合液加入培养的星形胶质细胞中，混匀，孵育48 h，采用Western blot检测EGFR siRNA的干扰效率。EGFR siRNA及Scramble siRNA核苷酸序列均由上海吉玛公司合成，其中EGFR siRNA正义链为：5′-CCUUAGCAGUCUUAUCUAATDT-3′，反义链为：5′-dTdTGGAAUCGUCAGAAUAGAUU-3′；Scramble siRNA正义链为：5′-UUCUCCGAACGUGUC ACGU-3′，反义链为：5′-ACGUGACACGUUCGGAG AA-3′。

将处于对数生长期的星形胶质细胞随机分为4组：对照组、CNTF组、 Scramble siRNA+CNTF组及EGFR siRNA+CNTF组，对照组仅给予DMEM培养液处理24 h，CNTF组用加入20 μg·L^-1 CNTF的DMEM培养液培育24 h，后2组分别给予Scramble siRNA、EGFR siRNA转染细胞后，用含20 μg·L^-1 CNTF的DMEM培养液处理24 h。每组实验重复5次，结果取平均值。

细胞处理完成后，收集足够的细胞，利用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，并溶解于无RNase的水中，通过紫外分光光度计测定每个样本总RNA 的OD₂₆₀/OD₂₈₀，其比值均在1.8~2.0之间，符合实验要求。取2 μg总RNA，依据逆转录试剂盒提供的方法合成cDNA。参照文献[3]由上海生工生物工程公司合成GFAP与磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物。GFAP引物序列：5′-TAATGACTATCGCCGCCAACTG-3′，5′-TTCGCCCTCCGCAATTT C-3′，扩增产物长度274 bp；GAPDH引物序列：5′-GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC-3′，5′-ATGCCTGC TTCACCACCACCTTG -3′，扩增产物长度454 bp。然后取10 μL逆转录产物，在Roach480实时定量PCR仪上进行PCR反应，反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性1 min，61℃复性30 s，72℃延伸30 s，总共35个循环，最后72℃延伸7 min。用ΔΔCt值法，以GAPDH表达水平作为内参照定量GFAP mRNA表达。

常规制备SDS-PAGE胶，采用三去污裂解液将脑组织及处理后的细胞(细胞数量充足)匀浆，吸出上清液，将20 μg蛋白质样品上样，在70 V电压下电泳1.5 h，转移至PVDF膜，以50 g·L^-1脱脂牛奶室温封闭后，分别加入1 ∶500稀释的兔抗人EGFR、β-actin或兔抗大鼠EGFR、GFAP、STAT3、p-STAT3、β-actin一抗，在低温条件下(4℃)孵育过夜，添加1 ∶2 500稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(二抗)室温孵育，ECL显色，暗室曝光。利用Labwork凝胶图像分析系统对胶片扫描，分析各产物积分光密度值，计算EGFR、GFAP、STAT3、p-STAT3相对量。目标蛋白表达水平=目标蛋白积分光密度值/β-actin积分光密度值.

实验数据采用 x±s表示，使用SPSS 16.0软件进行统计学分析，多组均数比较行单因素方差分析及两两之间比较行q检验。

免疫组织化学染色显示(Fig 1)，EGFR阳性颗粒呈棕黄色，以胞质多见，大量分布于脑出血后血肿周围脑组织中，主要位于胶质细胞，少数为神经细胞。灰度扫描与半定量分析结果表明(Fig 2)，5组脑组织EGFR阳性信号指数比较，差异有显著性(F=20.15,P<0.01)，其中脑出血后不同时期血肿周围脑组织EGFR阳性信号指数均高于对照组(P<0.01)；与<1 d组比较，1~5 d组、6~10 d组及>10 d组EGFR阳性信号指数明显升高(P<0.01)；与1~5 d 组比较，6~10 d组、>10 d组EGFR阳性信号指数增加(P<0.01)；6~10 d组EGFR阳性信号指数亦高于>10 d组(P<0.01)。此外，Western blot检测发现，5组脑组织EGFR蛋白表达水平的差异有显著性(F=23.68,P<0.01)，其变化趋势与阳性信号指数相似，见Fig 3。

Fig 1 EGFR immunohistostaining of cerebral tissues around hematomas after intracerebral hemorrhage during various periods A: Control group; B:<1 d group; C: 1~5 d group; D: 6~10 d group; E: >10 d group

图选项

Fig 2 Comparison of EGFR positive signal index in cerebral tissues around hematomas after intracerebral hemorrhage during various periods( x±s,n=20) **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs <1 d; △△P<0.01 vs 1~5 d; ▲▲P<0.01 vs >10 d

图选项

Fig 3 Expression of EGFR protein in cerebral tissues around hematomas after intracerebral hemorrhage during various periods( x±s,n=20) A: Control group; B: <1 d group; C: 1~5 d group; D: 6~10 d group; E: >10 d group. **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs <1 d; △△P<0.01 vs 1~5 d; ▲▲P<0.01 vs >10 d

图选项

将处于对数生长期的星形胶质细胞接种于涂有多聚赖氨酸盖玻片的24孔板，并加入 DMEM 培养液进行siRNA转染实验。Western blot检测显示，EGFR siRNA抑制星形胶质细胞EGFR蛋白表达水平达80%(Fig 4)，表明EGFR siRNA对EGFR基因的沉默效果较好，符合本实验要求。

Fig 4 Expression of EGFR protein in astrocytes among groups A: Control group; B: Scramble siRNA group; C: EGFR siRNA group

图选项

GFAP是星形胶质细胞活化的标记物，为了探讨EGFR对星形胶质细胞活化的影响，给予CNTF和(或)siRNA处理细胞后，通过荧光实时定量PCR、Western blot分别检测各组细胞GFAP mRNA、蛋白表达，结果显示(Fig 5、6)，4组GFAP mRNA与蛋白表达水平比较，差异有显著性(F=24.37、28.69，P<0.01)，其中对照组GFAP mRNA与蛋白 呈低水平表达，CNTF组、Scramble siRNA+CNTF组GFAP mRNA与蛋白表达水平较对照组明显增加(P<0.01)；与CNTF组、Scramble siRNA+CNTF组比较，EGFR siRNA转染细胞后，GFAP mRNA与蛋白表达水平下调(P<0.01)，但EGFR siRNA+CNTF组GFAP mRNA与蛋白表达水平与对照组相比，无明显改变(P>0.05)。此外，Scramble siRNA+CNTF组上述指标与CNTF组无区别(P>0.05)，这些结果表明EGFR基因沉默可抑制星形胶质细胞活化。

Fig 5 Expression of GFAP mRNA in astrocytes among groups( x±s,n=5) A: Control group; B: CNTF group; C: Scramble siRNA+CNTF group; D: EGFR siRNA+CNTF group. **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vsCNTF group and scramble siRNA+CNTF group

图选项

Fig 6 Expression of GFAP protein in astrocytes among groups( x±s,n=5) A: Control group; B: CNTF group; C: Scramble siRNA+CNTF group; D: EGFR siRNA+CNTF group. **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vsCNTF group and scramble siRNA+CNTF group

图选项

STAT3磷酸化(即活化形式)可以诱导GFAP基因转录，为了初步明确EGFR siRNA抑制星形胶质细胞活化的机制，利用Western blot检测各组细胞p-STAT3、STAT3蛋白表达(Fig 7)，发现各组细胞p-STAT3表达水平的差异有显著性(F=25.39,P<0.01)，其中CNTF组、Scramble siRNA+CNTF组p-STAT3表达水平较对照组升高(P<0.01)，给予EGFR siRNA转染细胞后，p-STAT3表达水平明显降低，与CNTF组、Scramble siRNA+CNTF组比较，差异有显著性(P<0.01)，但与对照组相比，变化不明显(P>0.05)；Scramble siRNA+CNTF组p-STAT3表达水平与CNTF组比较，差异无显著性(P>0.05)；此外，各组STAT3蛋白表达水平无区别(F=3.24,P>0.05)，提示EGFR基因沉默对星形胶质细胞活化的抑制作用可能与其阻滞STAT3磷酸化有关。

Fig 7 Expression of STAT3 and p-STAT3 in astrocytes among groups( x±s,n=5) A:Control group; B: CNTF group; C: Scramble siRNA+CNTF group; D: EGFR siRNA+CNTF group. **P<0.01 vs control group；##P<0.01 vsCNTF group and scramble siRNA+CNTF group

图选项

脑出血具有高发病率、致死率、致残率，目前已成为威胁人类健康与生活质量的重大疾病之一。星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的细胞，当中枢神经系统发生损伤时，星形胶质细胞活化，活化的星形胶质细胞具有双重作用。在损伤早期，星形胶质细胞通过分泌多种细胞因子，增强神经元对缺血、缺氧的耐受性，对神经元产生保护作用，促进其存活；但另一方面，星形胶质细胞可释放多种损伤因子，对神经元产生毒性作用，并且过度增生的星形胶质细胞是胶质瘢痕中的主要成分，可阻碍神经再生及轴突的形成^[4]。大量研究已经发现，星形胶质细胞活化的毒性作用超过其对神经元的保护作用，被认为是导致脑出血后继发性损伤的重要原因^{[5, 6]}。然而，通过白藜芦醇、孕酮抑制星形胶质细胞的异常活化，可明显减少神经元损伤^{[7, 8]}。脑损伤后，星形胶质细胞活化呈现出动态变化的规律，与神经元的受损程度基本同步，一般在脑损伤后数h~1d即可在损伤周围出现胞体肥大、突起增粗的活化星形胶质细胞，随着时间延长，死亡神经元数目增多，活化的星形胶质细胞数目也逐渐增多，在7~15 d达到高峰^[9]。EGFR广泛表达于上皮、间质及神经组织，在调控细胞增殖和分化中起重要作用。本研究结果表明，随着脑出血时间的延长，EGFR阳性信号指数及蛋白表达水平逐渐升高，6~10 d处于最高值，与星形胶质细胞活化过程基本同步。另有研究表明，脑卒中后，EGFR阳性细胞主要为反应性的星形胶质细胞^[10]。这些结果提示，EGFR在脑出血后血肿周围脑组织中表达持续升高，可能与星形胶质细胞活化密切相关。

GFAP 系星形胶质细胞的中间丝细胞骨架蛋白，为星形胶质细胞的特异性标记物。众多研究显示，脑出血后 GFAP 表达明显上调，星形胶质细胞呈活化状态^{[11, 12]}。CNTF是目前公认的星形胶质细胞的活化剂，当与其受体结合后导致STAT3磷酸化，磷酸化的STAT3随后与 GFAP 基因的启动子结合，GFAP 基因大量转录，刺激星形胶质细胞进入细胞周期增殖，胞体变大，突起增多、变长，细胞活化^{[13, 14]}。EGFR属于受体型酪氨酸蛋白激酶，由细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域3部分组成，EGFR细胞外结构域与配体表皮生长因子或转化生长因子α结合后，经跨膜结构域激活胞内结构域的酪氨酸激酶，形成磷酸化EGFR，从而激活下游多条信号转导通路，包括STAT3通路^{[15, 16]}。于晓棠等^[17]报道，EGFR通过STAT3磷酸化，促进大鼠肝癌的发生发展。siRNA是一类包含21~25个核苷酸的小RNA片段，与细胞内同源性靶基因的mRNA特异性结合，使mRNA发生降解而导致基因沉默。因siRNA具有稳定性好、特异性强、细胞毒性低以及作用持久、强大等优点，目前已成为基因功能研究的强大工具^[18]。本研究将EGFR siRNA转染星形胶质细胞后，发现其可抑制80%的EGFR蛋白表达，说明EGFR siRNA能够强烈干扰EGFR表达。本研究随后以CNTF和(或)EGFR siRNA处理星形胶质细胞，结果显示，CNTF单独处理可明显上调星形胶质细胞GFAP 表达，EGFR siRNA转染则完全逆转了CNTF对GFAP表达的诱导作用，与EGFR抑制剂的作用相似^[3]，表明EGFR基因沉默可抑制星形胶质细胞活化。为了进一步探讨其分子机制，我们采用Western blot检测各组细胞STAT3、p-STAT3表达，发现EGFR siRNA对STAT3整体蛋白水平无影响，但能明显抑制CNTF介导的p-STAT3水平上调，提示阻碍STAT3磷酸化可能是EGFR基因沉默抑制星形胶质细胞活化的重要机制。

综上所述，本研究结果表明，EGFR在脑出血后血肿周围脑组织中呈高表达，EGFR基因沉默对星形胶质细胞活化有良好的抑制作用，其机制可能与阻碍STAT3磷酸化有关。因此，EGFR可能成为抑制星形胶质细胞活化的一个潜在的、有价值的靶点，采用siRNA或抑制剂下调EGFR表达，对于脑出血等脑损伤疾病后的神经再生和功能恢复具有重要的意义。

( 致谢： 本实验在侗医药研究湖南省重点实验室和南华大学附属第一医院临床医学研究所完成，感谢谢明教授和武衡博士以及各位老师的指导和帮助。)