神经炎症是中枢神经系统的固有免疫应答反应，主要由脑内免疫细胞小胶质细胞和星形胶质细胞介导。当脑组织受到各种病理因素的损伤或刺激时，小胶质细胞和星型胶质细胞可由静息态转变为激活态，吞噬清除变性的神经组织碎片，因此适度激活的胶质细胞对神经元起保护作用[1]。但是在病理条件下，胶质细胞会被过度激活，引起神经炎症，释放大量的炎症因子，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)、谷氨酸盐和一氧化氮(nitric oxide,NO)等[2]，导致神经元功能丧失、变性甚至死亡，进而引起神经元的损伤。尽管神经炎症的机制还没有完全研究清楚，但是普遍认为神经炎症与多种神经系统退行性疾病的发病密切相关[3]。如在阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)患者的大脑皮层可见β淀粉样蛋白周围存在有大量激活的小胶质细胞和星型胶质细胞，在帕金森疾病(Parkinson’s disease,PD)患者中脑黑质纹状体部位有大量多巴胺能神经元的丢失，并伴有大量炎症因子的存在[4]。鉴于炎症反应在神经退行性疾病发病过程中的重要作用，控制疾病过程中的炎症反应将有助于神经退行性疾病的预防和治疗。因此，从抗炎的角度研究和开发具有神经保护作用的药物已成为当下研究的热点。丹参是我国的传统中药，临床上用于治疗心脑血管疾病如冠心病、心绞痛等已有悠久的历史。近年来，对丹参的研究发现，丹参中的丹参酮类物质具有良好的神经保护作用，表现在抗炎、抗氧化、抗凋亡和抑制兴奋性氨基酸毒性等多个方面[5]。中国医学科学院药物研究所生物合成室通过生物合成的方法从丹参的细胞培养物中分离获得的去氢丹参新酮(dehydromiltirone，结构见Fig 1)，经我们实验室的抗炎活性初筛后，发现其具有很好的抗炎活性。因此在本实验中，我们采用经典致炎剂脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小胶质细胞系BV2细胞建立体外神经炎症模型，进一步评价去氢丹参新酮的抗炎作用，并对其作用机制进行初步研究。
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| Fig 1 Chemical structure of dehydromiltirone |
去氢丹参新酮由中国医学科学院药物研究所生物合成室戴均贵教授提供，纯度99.5%，用DMSO配制成10-2 mol·L-1储备液，分装后于-20℃保存；DMEM培养基购自美国Gibco 公司；新生胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司；LPS购自默克密理博公司；兔抗NF-κB(p65)、兔抗p-Akt(Ser473)、兔抗Akt、兔抗p-PI3K(p85)、兔抗PI3K、小鼠抗p-IκBα、兔抗IκBα等抗体购自Cell Signaling Technology公司；兔抗COX-2抗体购自Abcam公司；兔抗CD11b抗体购自ABD Serotec公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；小鼠TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒为欣博盛生物科技有限公司产品；胞核-胞质蛋白制备试剂盒、ECL超敏发光液等购自北京普利莱基因技术有限公司。
1.2 仪器MQX-200酶标仪(Bio-TeK.Instruments Inc.,USA)；Sigma 2K15离心机；垂直电泳仪和电转移系统(北京六一仪器厂)；LAS4000化学发光系统(GE公司,USA)；FV1000MPE Multiphoton Laser Scanning Microscope(奥林巴斯，日本)。
2 方法 2.1 细胞培养小胶质细胞系BV2细胞由中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供，于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，每隔2~3天传代，所用消化液为0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA。
2.2 MTT法检测细胞毒性取对数生长期的BV2细胞，经消化计数后，以5.0×103个/孔接种于96孔板中，培养24 h后加入不同浓度去氢丹参新酮(1、5、10 μmol·L-1)，每组设6个复孔。继续培养24 h，小心吸去培养基，每孔加入100 μL 0.5 g·L-1的MTT，继续37℃孵育4 h后，弃去上清液，每孔中加入200 μL DMSO，振荡5 min以使结晶充分溶解，于酶标仪540 nm波长处测定吸光度值。以对照组细胞存活率为100%，计算不同处理组细胞的存活率。
2.3 NO测定采用Griess法测定亚硝酸盐(NO2-)的含量来反映NO的浓度。取对数生长期的BV2细胞，经消化计数后，以5×103个/孔接种到96孔板中，培养24 h后，加入不同浓度的去氢丹参新酮(1、5、10 μmol·L-1)预孵育1 h，然后加入LPS(1 mg·L-1)继续培养24 h，收集上清100 μL，加入等体积Griess试剂(以蒸馏水配制0.1%奈乙二胺，以5%磷酸配制1%对氨基苯磺酸，两者在临用前以1 ∶1等体积混合)，室温静置10 min，蒸馏水调零，在酶标仪上测定540 nm处吸光度值，同时以硝酸钠为标准品，测定吸光度值，计算亚硝酸盐的含量。
2.4 酶联免疫吸附测定(ELISA)BV2细胞以5.0×104个/孔接种于24孔板，待细胞贴壁后，加入去氢丹参新酮(1、5、10 μmol·L-1)预孵育1 h，加入LPS(1 mg·L-1)继续培养，分别在3 h和12 h后收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，测定细胞上清液中TNF-α和IL-6的含量。
2.5 免疫荧光实验24孔板内放置无菌玻璃片，BV2细胞以合适密度接种于24孔板中培养，待细胞贴壁后，加入去氢丹参新酮10 μmol·L-1预孵育1 h，再加入LPS(1 mg·L-1)继续培养24 h。细胞用4％多聚甲醛室温下固定20 min，然后用0.5% Triton X-100室温通透10 min，PBS洗3次，在玻片上滴加3%正常山羊血清，室温下封闭2 h后，加入兔抗CD11b一抗(1 ∶250，PBS稀释)，4℃孵育过夜。PBS洗3次，加入FITC标记的二抗，37℃避光孵育60 min。PBS洗涤后，滴加3 mg·L-1 DAPI，避光孵育5 min对标本进行核染，洗去多余的DAPI，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，激光共聚焦显微镜下观察采集图像。
2.6 Western blot取处于对数生长期的BV2细胞，用胰酶消化后收集细胞计数，以5×107·L-1浓度接种于75 mm2培养瓶中，不同浓度的去氢丹参新酮(1、5、10 μmol·L-1)预孵育1h后，加入LPS(1 mg·L-1)，于37℃培养箱中继续培养3 h后，检测PI3K/Akt信号通路蛋白变化，24 h后检测NF-κB信号通路及iNOS和COX-2蛋白表达变化，收集细胞，并按照胞核-胞质蛋白制备试剂盒说明书提取胞质和胞核蛋白，BCA法测定蛋白浓度。制备好的蛋白质样品经12% SDS-PAGE电泳分离，然后转移到PVDF膜上，室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h后，分别加入抗NF-κB(p65)、p-Akt(Ser473)、Akt、p-PI3K(p85)、PI3K、p-IκBα、IκBα、iNOS、COX-2等的一抗(1 ∶1 000,TBST稀释)，4℃过夜，TBST洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育1 h，应用LAS4000化学发光系统检测。灰度分析采用Quantity One软件，以目的蛋白与内参蛋白灰度的比值表示目的蛋白的相对表达。
2.7 统计学分析用SPSS 19.0软件进行统计学分析。各组结果以 x±s 表示，各组间的差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。
3 结果 3.1 去氢丹参新酮对BV2细胞存活率的影响在确定去氢丹参新酮的给药浓度之前，我们首先明确去氢丹参新酮在BV2细胞上的安全剂量范围，因此我们采用MTT法观察去氢丹参新酮对BV2细胞存活率的影响，以确定去氢丹参新酮的无毒剂量范围。如Fig 2所示，不同剂量的去氢丹参新酮(1、5、10 μmol·L-1)与BV2细胞共孵育24 h后，细胞存活率没有受到明显的影响，提示去氢丹参新酮在该剂量范围下无细胞毒性。因此，后续实验中去氢丹参新酮的给药浓度为1、5、10 μmol·L-1。
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| Fig 2 Effects of dehydromiltirone on viability of BV2 cells The cells were treated with various concentrations of dehydromiltirone for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. The data are expressed as x±s from three independent experiments. Results are displayed as the percentages of the control group. |
NO作为细胞内重要的信使分子，参与神经递质的释放和重摄取、神经传导和突触可塑性等重要的生理过程，但是过量产生的NO也可以引起严重的神经毒性[6]。Fig 3结果显示,LPS(1 mg·L-1)与BV2细胞共同孵育24 h可激活小胶质细胞，使NO产生大量增加，而去氢丹参新酮在10 μmol·L-1浓度时可明显抑制NO的产生，5和1 μmol·L-1浓度时有降低NO的趋势，但差异无统计学意义。
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| Fig 3 Effects of dehydromiltirone on nitric oxide production in LPS-stimulated BV2 cells BV2 cells were treated with 1 mg·L-1 LPS in the presence or absence of dehydromiltirone for 24 h, the nitrite in supernatants was determined using the Griess reaction. Data are presented as x±s from three independent experiments. Results are displayed as the percentages of the control group.#P< 0.05 vs control group;**P< 0.01 vs LPS treated group. |
激活的小胶质细胞释放过量的炎症因子是造成神经元损伤、导致神经功能障碍的主要因素[7]。TNF-α和IL-6是两类常见的炎症因子，故本实验中进一步检测了去氢丹参新酮对LPS刺激BV2细胞产生的TNF-α和IL-6的影响。结果如Fig 4所示，对照组BV2细胞中TNF-α、IL-6的分泌量很低，与对照组相比，LPS(1 mg·L-1)刺激BV2细胞后，可使二者的释放量明显升高，提示LPS激活了小胶质细胞，产生炎症反应。同模型组相比，去氢丹参新酮给药可明显降低二者的释放，表明去氢丹参新酮对LPS刺激BV2细胞产生的炎症因子具有抑制作用。
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| Fig 4 Effects of dehydromiltirone on secretion of cytokines in BV2 cells stimulated by LPS A: The cells were cultured with LPS in the presence or absence of dehydromiltirone for 3 h. The concentration of TNF-α in the supernatants was assayed by ELISA. B: The cells were cultured with LPS in the presence or absence of dehydromiltirone for 12 h. The concentration of IL-6 in the supernatants was assayed by ELISA. Data are presented as x±s for three independent experiment. #P< 0.05 vs control group;*P<0.05,**P < 0.01 vs LPS treated group. |
巨噬细胞抗原复合体-1(macrophage 1 antigen,MAC-1)是表达于小胶质细胞上的补体受体，由CD11b和CD18两个亚基组成。MAC-1在活化的小胶质细胞中表达量增加，常作为小胶质细胞活化的标志分子[8]。如Fig 5所示，LPS(1 mg·L-1)刺激BV2细胞24 h后，MAC-1蛋白表达明显增加，表现为绿色荧光明显增强。提前加入去氢丹参新酮预孵育1 h，能够明显抑制MAC-1的表达，镜下可见绿色荧光强度减弱。该结果表明去氢丹参新酮对LPS引起的小胶质细胞的活化具有一定的抑制作用。
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| Fig 5 Effects of dehydromiltirone on activation of CD11b in LPS-stimulated BV2 cells Cells were pretreated with dehydromiltirone for 1 h followed by LPS stimulation for 24 h. CD11b was probed by anti-CD11b antibody and FITC-conjugated secondary antibody. The nuclei were stained by DAPI and the images were captured by confocal microscopy. Bar=20 μm. |
小胶质细胞上表达的多种蛋白均参与小胶质细胞活化后引起的炎症反应。诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)可由多种炎症刺激物如LPS和细胞因子等诱导产生，其活性增强和表达增多常作为炎症反应的标志[9]。环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在炎症刺激下诱导表达，其催化产生的前列腺素E2也是神经炎症反应过程中的重要因素。实验结果显示，LPS(1 mg·L-1)刺激BV2细胞24 h后，iNOS和COX-2蛋白表达明显增加，提示LPS刺激可引起炎症蛋白的高表达，而提前加入去氢丹参新酮预孵育，可分别剂量依赖性地抑制LPS引起的iNOS、COX-2表达增加，表现出良好的抑制神经炎症的作用(Fig 6)。
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| Fig 6 Effects of dehydromiltirone on LPS-induced iNOS and COX-2 protein expression in BV2 cells Cells were pretreated with 1,5,10 μmol·L-1 of dehydromiltirone for 1 h and then incubated with LPS for 24 h, total cellular protein was subjected to Western blot analysis with antibody against iNOS (A) or COX-2 (B). Data are presented as x±s from three independent experiments. #P< 0.05 vs control group;*P<0.05,**P < 0.01 vs LPS treated group. |
核转录因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路是介导炎症反应的重要信号通路[10]。为了阐明去氢丹参新酮的抗炎作用机制，我们检测了去氢丹参新酮对该信号通路的影响。Western blot结果显示，未经LPS处理的BV2细胞内IκBα磷酸化水平较低，而LPS(1 mg·L-1)可引起IκBα磷酸化水平明显增加，胞质中IκBα蛋白的表达水平则无明显改变，提前1h用去氢丹参新酮(1、5、10 μmol·L-1)预孵育BV2细胞，可以抑制LPS诱导的IκBα的磷酸化水平升高，其中5、10 μmol·L-1的去氢丹参新酮作用较为明显。对NF-κB p65亚基的研究发现，LPS(1 mg·L-1)刺激BV2细胞24 h后，胞质中NF-κB p65水平明显降低，而胞核中NF-κB p65水平明显提高，表明LPS可引起NF-κB信号通路的活化，使NF-κB p65亚基向核内转移，而去氢丹参新酮可以剂量依赖性地抑制NF-κB p65亚基的核转位，表明去氢丹参新酮抗炎作用的发挥与抑制NF-κB信号通路有关(Fig 7)。
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| Fig 7 Effects of dehydromiltirone on phosphorylation of IκBα and activation of NF-κB in LPS-stimulated BV2 cells Cells were pretreated with 1,5,10 μmol·L-1 of dehydromiltirone for 1 h and then incubated with LPS(1 mg·L-1) for 24 h. Protein was subjected to Western blot analysis. Data are presented as x±s from three independent experiment. #P< 0.05 vs control group;*P<0.05,**P < 0.01 vs LPS treated group. |
NF-κB作为多条炎症信号通路的共同作用靶点，可被多种上游信号分子激活，其中磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)-丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路不仅在促进细胞增殖、抑制凋亡的过程中发挥着重要作用，在炎症反应中也发挥着重要的作用。已有大量文献报道PI3K/Akt可以调控NF-κB信号通路[11]，进而调控神经炎症，因此我们也检测了去氢丹参新酮对该信号通路的影响。Fig 8结果显示,与 对照组相比，模型组PI3K和Akt的磷酸化水平明显升高，表明PI3K/Akt信号通路在LPS的刺激下激活。同模型组相比，去氢丹参新酮可以明显抑制PI3K和Akt的磷酸化，该结果表明去氢丹参新酮可以通过抑制PI3K/Akt信号通路而减少LPS刺激对核转录因子NF-κB的激活，从而减轻炎症反应。
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| Fig 8 Effects of dehydromiltirone on phosphorylation of p85 and Akt in LPS-stimulated BV2 cells Cells were pretreated with 1,5,10 μmol·L-1 of dehydromiltirone for 1h and then incubated with LPS(1 mg·L-1) for 3 h. Whole cell extracts were prepared and analyzed by immunoblotting. Data are presented as x±s from three independent experiments. #P< 0.05 vs control group;*P<0.05,**P < 0.01 vs LPS treated group. |
本研究表明，去氢丹参新酮对LPS刺激BV2细胞产生的炎症因子NO、TNF-α和IL-6具有明显的抑制作用，对小胶质细胞表面活化标志物MAC-1及炎症因子蛋白合成酶iNOS和COX-2的表达具有明显的抑制作用，去氢丹参新酮具有很好的抑制神经炎症的活性，其作用机制可能是通过调控PI3K/Akt信号通路抑制IκB的磷酸化，进而抑制NF-κB的核转位而实现的。
丹参在活血化瘀、改善微循环和抑制血小板聚集等方面有着明确的疗效，复方丹参片和复方丹参滴丸等由丹参制成的药物现广泛应用于临床。大量的研究已表明丹参中的丹酚酸类物质是其发挥心脑血管保护作用的主要成分[12]，但是丹参药材中代表成分多达几十种，对丹参中其他活性成分的药理作用研究具有重要的意义。已有文献报道，丹参中的丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I等均具有较好的抗炎活性[13]，具有保护神经元的作用。去氢丹参新酮在结构上与其他丹参酮类物质相似，但尚未见有关其对神经炎症作用的报道。在本实验中，我们观察到去氢丹参新酮对LPS刺激BV2细胞产生的炎症因子的释放和炎症蛋白的表达具有明显的抑制作用，表明去氢丹参新酮具有很好的抑制神经炎症的作用。
NF-κB是与炎症及凋亡有关的重要转录因子，静息状态下与其抑制子(inhibitor of κB,IκB)结合，以二聚体形式存在于细胞质内，激活后，IκB降解，NF-κB从胞质转移到核内，引起相关炎症因子基因的转录和表达，是介导炎症反应的重要信号通路。已有大量研究表明，核内NF-κB的增多和iNOS、IL-1β及TNF-α的表达密切相关[14]。在本实验中，我们观察到去氢丹参新酮能抑制LPS诱导的NF-κB p65亚基转位入核，其变化情况与炎症因子NO、TNF-α和IL-6及炎症相关蛋白iNOS和COX-2的变化趋势基本一致，提示去氢丹参新酮对LPS诱导的炎症反应的抑制作用至少部分是通过抑制NF-κB的活化来实现的。NF-κB作为多条炎症信号通路的共同作用靶点，受多种上游信号分子的调控。PI3K的活化导致磷脂酰激醇的磷酸化，进而激活下游分子Akt，活化的Akt可以激活IκB激酶，从而使NF-κB从细胞质中释放出来，进行核转位，激活其靶基因，进而促进多种炎症因子的表达。PI3K和Akt的磷酸化在LPS刺激后明显增加，而去氢丹参新酮可以抑制PI3K和Akt的磷酸化，表明去氢丹参新酮可以通过PI3K/Akt信号通路抑制NF-κB的激活，发挥抗炎作用。
综上所述，去氢丹参新酮具有很好的抗炎作用，有望成为新型的神经保护剂，但其成药性和作用机制尚需进行更加深入的研究。
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