2. 河北中医学院中西医结合学院内科教研室, 河北省中西医结合肝肾病重点实验室, 河北 石家庄 050091
2. College of Integrated Chinese and Western Medicine, Hebei University of Chinese Medicine, Hebei Key Laboratory of Integrative Medicine on Liver-kidney patterns, Shijiazhuang 050091, China
肾间质纤维化(RIF)是各种慢性肾脏疾病发展到终末期肾衰竭的共同病理改变[1]。其主要病理特点为脏器萎缩、细胞外基质(ECM)过度积聚和细胞增生。研究表明，血清糖皮质激素诱导蛋白激酶1(SGK-1)、转化生长因子β1(TGF-β1)等致纤维化因子在醛固酮的诱导下促进细胞增殖及ECM积聚，造成肾脏硬化[2, 3]。
本实验采用单侧输尿管结扎梗阻大鼠模型，激活肾素-血管紧张素-醛固酮(RAAS)系统，诱导醛固酮活化致肾间质纤维化。观察其阻断剂依普利酮对细胞增殖标志物增殖细胞核抗原(PCNA)、血清糖皮质激素诱导蛋白激酶1(SGK-1)、转化生长因子β1(TGF-β1)的调控作用，探讨依普利酮拮抗醛固酮活化所致肾间质纤维化的可能作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物及分组选用清洁级♀ Wistar大鼠36只，体质量(200±20) g，购自河北医科大学动物实验中心，随机分为假手术组、UUO组及依普利酮组(n=12)。
1.2 药物、试剂和主要仪器依普利酮为美国Pfizer公司产品,日本Research Diets. Inc公司根据动物进食量及药物用量(100 mg·kg-1·d-1)按1.25 g·kg-1加入饲料中；PCNA抗体选用Epitomics产品；SGK-1抗体选用Affbiotech产品；TGF-β1、GAPDH抗体均选用Bioworld Technology产品；电泳仪及电泳槽(北京六一公司)，OLYMPUS VANOX PM-10AD型显微照相仪(日本OLYMPUS公司)，LEICA RM 2245型石蜡切片机(德国LEICA上海分公司)。
1.3 造模方法及给药实验动物适应性喂养1周后，复制梗阻性肾病模型，10%水合氯醛注射麻醉，于腹部左侧切开，游离左侧输尿管，于输尿管上1/3处和中1/3处结扎后切断并缝合，假手术组仅游离输尿管。治疗组给以大鼠依普利酮100 mg·kg-1·d-1。治疗10 d后摘取左侧肾脏，4%多聚甲醛中固定、石蜡包埋，切片行常规HE、Masson及免疫组化染色；剩余组织-70℃保存用于Western blot检测蛋白表达。
1.4 观察指标及方法 1.4.1 HE、Masson染色观察肾脏组织形态学改变 1.4.2 免疫组化检测PCNA、SGK-1、TGF-β1表达采用SABC法检测，一抗浓度均为1 ∶100 。
1.4.3 Western blot检测PCNA、SGK-1、TGF-β1蛋白表达冰冻肾组织100mg加裂解液(含蛋白酶抑制剂) 0.4 mL，提取蛋白并测定含量； 取样品上样蛋白20μg，电泳后转膜，5%脱脂牛奶封闭,加入一抗SGK-1、PCNA、GAPDH抗体(1 ∶1000)，TGF-β1抗体(1 ∶500)，4℃过夜，清洗3次，加入兔二抗(1 ∶20 000)孵育后显影，与所得内参进行校正后比较。
1.5 统计学方法数据资料结果采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。采用单因素方差分析(One-way ANOVA),数值变量以x± s 表示。
2 结果 2.1 各组大鼠肾脏组织病理学改变HE染色结果假手术组肾脏偶见炎性细胞浸润，间质无水肿，小管无扩张，上皮细胞排列整齐；UUO组大鼠肾脏有大量炎性细胞浸润，肾小管扩张明显，上皮细胞脱落；依普利酮组远端小管扩张程度及上皮细胞脱落与UUO组大致相同，但炎性细胞浸润较UUO组明显减少(Fig 1)。Masson染色结果：假手术组大鼠肾脏间质中可见少量胶原纤维成分表达，肾小管和肾小球基底膜结构清晰。UUO组肾小管间质中有大量胶原纤维成分沉积，肾脏结构紊乱。依普利酮组胶原纤维成分表达与假手术组相比增多，与UUO组相比胶原纤维成分明显减少(Fig 2)。
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Fig 1
HE staining of kidney in rats with UUO(×200)
 ：Inflammatory cells；：The expansion of the renal tubules
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Fig 2
Masson staining of kidney in rats with UUO(×200)
 ：Composition of collagen
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PCNA在假手术组中仅有少量表达，见于肾小管。模型组阳性细胞明显增多，以肾小管上皮细胞及间质表达为甚；依普利酮组与模型组相比，PCNA阳性细胞数明显减少，主要见于肾小管(Fig 3)。
2.3 肾组织SGK-1及TGF-β1的表达假手术组SGK-1及TGF-β1呈弱表达，主要表达于肾小管上皮细胞，SGK-1以远端小管为主；模型组中SGK-1及TGF-β1表达明显增强，主要见于肾小管上皮及间质细胞：依普利酮组SGK-1及TGF-β1表达范围及强度较模型组均明显减弱(Fig 4、5、)。
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Fig 3
Expression of PCNA in UUO rats with immunohistochemistry (×200)
：Expression of PCNA in renal tubular epithelial cells
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Fig 4
Expression of SGK-1 in UUO rats with immunohistochemistry(×100)
：Expression of SGK-1 in renal tubular epithelial cells
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Fig 5
Expression of TGF-β1 in UUO rats with immunohistochemistry(×200)
：Expression of TGF-β1 in renal tubular epithelial cells
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采用Western blot检测肾组织PCNA、SGK-1及TGF-β1蛋白表达，结果显示模型组PCNA、SGK-1及TGF-β1表达与假手术组相比明显增强，差异有统计学意义(P＜0.01)；依普利酮组的表达与模型组相比明显减弱，差异有统计学意义(P＜0.05)，见Tab 1、Fig 6。
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| Fig 6 Expression of PCNA, SGK-1,TGF-β1 in UUO rats with Western blot |
| (x± s ,n=3) | |||
| Group | PCNA/GAPDH | SGK-1/GAPDH | TGF-β1/GAPDH |
| Sham | 0.4579±0.0458 | 0.4608±0.1561 | 0.0826±0.0166 |
| UUO | 1.1113±0.1922** | 1.5957±0.2680** | 0.7216±0.0792** |
| Epl | 0.6479±0.2075△ | 1.0605±0.2224△ | 0.3680±0.0656△ |
| **P＜0.01 vs sham; △P＜0.05 vs UUO | |||
慢性肾衰竭是所有慢性肾脏疾病发展的最终结局，其病理改变是肾间质纤维化。肾间质纤维化常伴有肾小管萎缩、间质炎性细胞浸润、成纤维细胞聚集以及间质基质沉积等特征性病理改变。随着对RAAS系统的深入了解，研究证实RAAS的激活是引起慢性肾脏病的重要因素之一[4]，醛固酮作为RAAS系统的重要效应分子，可作为独立危险因素直接参与慢性肾脏疾病的进展[5]。新的研究发现，醛固酮除可调节肾脏电解质及水的排泄外，也参与炎性损伤、氧化应激、胶原沉积等多种病理反应[6]。细胞增殖及ECM的沉积是导致肾小球硬化和间质纤维化的重要因素之一。细胞增殖多出现在ECM沉积之前，并持续存在于ECM的沉积及肾间质纤维化发展过程中[7]，故抑制醛固酮活化诱导的肾小管上皮细胞及间质细胞增殖作用可相对减少ECM的沉积，减缓肾间质纤维化进程，对于减缓慢性肾脏病的进展具有重大意义。
PCNA 在肾脏病的进展中反映着细胞的增殖状态，有研究表明UUO术后3d肾脏PCNA表达明显增强[8]，我们的研究也发现梗阻24 h后PCNA阳性细胞开始增多并持续于整个实验(结果待发表)，主要以上皮细胞及间质细胞为主，增殖的细胞分泌细胞外基质参与纤维化的进展。故有效抑制细胞增殖对减缓肾间质纤维化具有重要作用。
细胞增殖与多种血管活性物质及细胞生长因子等有关，以往对Ang II较为重视，近几年通过对醛固酮的深入研究，醛固酮活化在肾脏病的损伤中有着更为重要的意义，醛固酮活化的作用途径有多种，其中SGK-1途径在炎性损伤中发挥着重要作用。SGK-1的经典作用是对肾小管中钠离子代谢的调节。此外SGK-1是重要的细胞内信号转导通路及细胞磷酸化级联反应的功能性交汇点，研究表明醛固酮可刺激SGK-1介导肾脏炎症反应及纤维化[9]。在梗阻性肾病大鼠实验中，醛固酮活化诱导SGK-1在肾组织中表达增强[10, 11]，导致氧化应激、炎性损伤，并上调促纤维化因子CTGF的表达，引起MMPs/TIMPs的失衡，加速脏器纤维化进程[12]。故SGK-1目前被认为是醛固酮促脏器纤维化、氧化应激及炎性损伤的主要效应介质[13]。亦有研究表明梗阻性肾病动物中肾小管上皮细胞的表型转化与SGK-1的上调密切相关，敲除SGK-1基因可减轻 UUO诱导的细胞表型转化[11]。SGK-1主要参与细胞内信号传导，与NF-кB的活化密切相关，有研究提示醛固酮可通过SGK-1诱导大鼠系膜细胞促纤维化因子CTGF分泌及NF-κB的活化[14]。醛固酮活化诱导的炎性损伤可通过SGK-1/NF-κB信号通路促纤维化，故SGK-1在醛固酮促纤维化中发挥着重要作用[15]。本研究主要观察醛固酮诱导的细胞增殖以及信号传导，结果显示梗阻性肾病诱导的醛固酮活化通过SGK-1通路刺激肾小管上皮细胞增殖，参与纤维化的进展，给予依普利酮治疗后，细胞增殖得以抑制，其作用与下调SGK-1相关。
此外，经典途径TGF-β1作为重要的致纤维化细胞生长因子，对细胞增殖的作用依然存在，其高表达是Ang II还是醛固酮诱导尚需进一步证实，但通过抑制醛固酮活性，可以同时下调其表达，抑制细胞的增殖，减轻纤维化病变。
新型盐皮质激素受体阻断剂依普利酮与螺内酯相比，具有高度选择性，可竞争性抑制盐皮质激素受体与醛固酮的结合，从而阻止醛固酮受体复合物的形成及活化所诱导的肾间质纤维化进程。对肾脏具有一定的保护作用[9, 16]。已有实验证实，依普利酮可有效抑制醛固酮的活化，抑制细胞增殖和细胞外基质过度分泌，保护肾功能[17, 18]。本实验主要通过采用UUO方式复制肾间质纤维化模型，激活RAAS系统，诱导醛固酮活化上调SGK-1表达介导肾小管上皮细胞增殖作用，研究其阻断剂依普利酮可通过下调SGK-1表达抑制梗阻性肾病细胞增殖从而达到减轻肾间质纤维化的作用。之前我们曾观察依普利酮通过下调TNF-α、NF-κB抑制细胞表型转化，减轻肾间质纤维化的作用[16]，这次研究以细胞增殖为重点，观察醛固酮活化上调SGK-1表达对细胞增殖标记物增殖细胞核抗原(PCNA)的作用。结果显示依普利酮可通过下调SGK-1、TGF-β1的表达，抑制细胞的增殖及ECM的沉积，从而减缓肾间质纤维化的进程，减轻肾脏损伤。
(致谢：衷心感谢河北省中西医结合肝肾病重点实验室各位老师的支持与帮助。)
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