灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand. -Mazz.)系忍冬科忍冬属的植物，其花蕾为《中华人民共和国药典》2005版以来收载的山银花药材第一植物来源。灰毡毛忍冬花蕾性甘、寒；归肺、心、胃经，有清热解毒，疏散风热的功效[1]，具有抑菌抗病毒[2, 3, 4]、解热抗炎[5, 6, 7]、保肝利胆[8, 9]、免疫调节[4]等药理作用，有很大的临床药用价值。灰毡毛忍冬花蕾的主要化学成分为有机酸类、皂苷类、黄酮类等，其中所含皂苷以灰毡毛忍冬皂苷乙(macranthoidinB，mB)和川续断皂苷乙(dipsacosideB，dB)最具代表性[10]。因为其含量丰富，两种皂苷的总含量通常达到5%以上，目前被作为2010年版《中华人民共和国药典》区别于忍冬的主要鉴定成分。
研究显示，部分药材的皂苷在血管内给药时具有溶血的特点[11]。1984年贵州省药材公司王玉英等在《中药材科技》第2期上曾报道过“灰毡毛忍冬蒸晒品无溶血性,而生晒品有溶血性。如作注射液原料,必须采用蒸晒品”[12]。自此，灰毡毛忍冬一直被认为具有溶血作用，但课题组查遍了近30年来能查到的所有资料，未见任何有关灰毡毛忍冬溶血性的其他报道。为了弄清这一问题的客观情况，本试验采用2种方法，对灰毡毛忍冬花蕾提取物及其所含的两种主要皂苷(灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙)是否具有溶血特性，在体内外进行了研究，以期为灰毡毛忍冬花蕾的正确认识和合理使用提供参考。
1 仪器与材料 1.1 仪器EL204电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，7DL-40B普通离心机(上海安亭科学仪器厂)，UV3010紫外分光光度计(日本高新)，SHH-150L生化培养箱(重庆永生试验仪器厂),XSZ-H双目生物显微镜(重庆光电)等。
1.2 动物新西兰大白兔10只，♀♂各半，体质量2～3 kg(SPF级，质量合格证号：0003225)；KM小鼠70只，♀♂各半，体质量18～22 g(SPF级，质量合格证号：0003222)。两种动物均购于重庆市中药研究院实验动物研究所(生产许可证号：2012-0006)。饲养于西南大学药学院SPF级实验动物中心(实验动物使用许可证号：SYXK(渝)2009-0002)。
1.3 试剂与药品自制灰毡毛忍冬花蕾提取物，灰毡毛忍冬干燥选花花蕾来源于重庆秀山，批号：20140628，经西南大学齐红艺教授鉴定为忍冬科忍冬属植物灰毡毛忍冬的干燥花蕾。该花蕾的产地加工方法为：采用蒸汽杀青热风干燥机(JYH150型，重庆市农科院农机研究所研制生产)加工，采收24 h内120 ℃蒸汽杀青5 min，80 ℃干燥35 min。将灰毡毛忍冬花蕾粉碎，过60目筛，称取一定量粉末于锥形瓶中，加适量70%乙醇，物料比为1 ∶8,70 ℃下回流提取4.5 h，抽滤，滤液真空冷冻干燥得到提取物，备用。1 g提取物相当于生药量187.5 g。
灰毡毛忍冬皂苷乙标准品(纯度98%，上海源叶生物科技有限公司，ZM0510BC13)；川续断皂苷乙标准品(纯度98%，上海源叶生物科技有限公司，KS0905CA14)；红细胞稀释液测试盒(100 mL/瓶，C037)、网织红细胞计数液(含网织红细胞染色储备液，16mL/瓶；网织红细胞染色稀释液，60 mL/瓶，C043)及氰化高铁血红蛋白测试盒(1 mL/支，C021)，均购于南京建成生物工程研究所；蒸馏水、生理盐水等。
2 方法 2.1 体外溶血试验 2.1.1 体积分数0.02的红细胞悬浮液制备心脏取血法取兔血2~3 mL，放入烧杯中用脱脂棉球棒轻微搅拌5～10 min，除去纤维蛋白原，使之成为脱纤血液。加入0.9%氯化钠溶液约10倍量，摇匀，1 200 r·min-1离心15 min，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9%氯化钠溶液按上述方法洗涤 2～3 次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞溶液用0.9%氯化钠溶液配成体积分数0.02的红细胞混悬液(每100 mL混悬液含红细胞溶液2 mL)，待用[13]。
2.1.2 供试溶液制备分别用灰毡毛忍冬花蕾提取物(hH)、灰毡毛忍冬皂苷乙(mB)、川续断皂苷乙(dB)标品以生理盐水配成100 mg·L-1的母液，再用生理盐水稀释成5、10、20、30、40、50、60、70、80、90 mg·L-1的梯度浓度溶液，备用。
2.1.3 肉眼观察法3种药物每种分别取洁净试管13只，进行编号:1号管为阴性对照管(生理盐水)，2号管为阳性对照管(蒸馏水)，3~13号管为供试品管(不同浓度药物)。每管均加入2%红细胞悬液2.5 mL后，1号管再加入生理盐水2.5 mL，2号管再加入蒸馏水2.5 mL，3~13号管再分别加入生理盐水2.2 mL和不同浓度的受试物0.3 mL，使每管溶液总量均为5 mL。混匀后，立即置于 37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育，开始每隔15 min观察1次，1 h后，每隔1 h观察1次，观察3 h。
2.1.4 分光光度法① 最大吸收波长的确定：取蒸馏水2.5 mL，加入2%红细胞悬液2.5 mL，混匀，置于37 ℃恒温水浴箱中保温30 min后，取出后离心5 min(r=1 500 r·min-1),吸取上清液在紫外分光光度计上扫描，以0.9%氯化钠溶液为对照，确定最大吸收波长为545 nm[13, 14]。② 离心时间及转速的确定：取生理盐水2.5 mL，加入2%红细胞悬液2.5 mL作为阴性对照，37℃温育30 min，分别以1 500、2 000、2 500、3 000 r·min-1的转速离心5、10、15 min，取上清液于最大吸收波长545 nm处测定吸光度[14]。结果见Fig 1。可见，吸光度随时间以及转速的增加呈下降趋势，故确定离心时间为5 min，转速为3 000 r·min-1(Fig 1)。③ 检测步骤：3种药物分别取洁净试管13只，进行编号，1号管为阴性对照管(生理盐水)，2号管为阳性对照管(蒸馏水)，3~13号管为供试品管(不同浓度药物)。每管均加入2%红细胞悬液2.5 mL后，1号管再加入生理盐水2.5 mL,2号管再加入蒸馏水2.5 mL，3~13号管再分别加入生理盐水2.2 mL和不同浓度的受试物0.3 mL，使每管溶液总量均为5 mL。混匀后，立即置于37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育，开始每隔15 min观察1次，1 h后，每隔1 h观察1次，观察3 h。3 h后将各管溶液离心，取上清，在分光光度计上，最大吸收波长处以生理盐水为空白读取各管的OD值。④ 结果判断：用下式计算各试验管的溶血率％。
|
| Fig 1 Absorbance changes in different rotate speed and centrifugation time |
溶血率/％＝(ODt-ODnc)/(ODpc-ODnc)×100％ 。式中，ODt：试验管吸光度；ODnc：阴性对照管吸光度；ODpc：阳性对照管吸光度。参考评价标准：溶血率>5％表明有溶血发生[13]，并进行统计学处理。
2.2 体内溶血试验 2.2.1 动物分组及给药KM小鼠70只，适应性喂养1周后，进行随机分组。设灰毡毛忍冬花蕾提取物2.275 g·kg-1(生药量)组,1.137 g·kg-1(生药量)组；灰毡毛忍冬皂苷乙0.110、0.055 g·kg-1组；川续断皂苷乙0.020、0.010 g·kg-1组；生理盐水组。每组10只。提取物以生理盐水分别稀释成75.8、37.9 g·L-1；灰毡毛忍冬皂苷乙以生理盐水分别稀释成3.60、1.80 g·L-1；川续断皂苷乙以生理盐水分别稀释成0.66、0.33 g·L-1。尾静脉给药[0.1 mL·(10 g)-1·d-1［15]］，连续给药7 d。
2.2.2 红细胞计数参考文献方法[16]，于给药前，末次给药后30 min断尾取血，准确吸取10 μL，将其加入2 mL稀释液中，充分混匀，用计数板在显微镜下计数。
2.2.3 网织红细胞计数参考文献方法[16]，于给药前，末次给药后30 min断尾取血，处理，显微镜下观察，用计数板计数1 000个红细胞中网织红细胞数目。
2.2.4 血红蛋白含量测定参考文献方法[16]，于给药前，末次给药后30 min断尾取血，准确吸取10 μL，加入到2.5 mL HICN稀释液中，回洗3次，混匀后静置5 min，分光光度计用蒸馏水调零，540 nm处测定各管吸光度A值，血红蛋白含量(g·L-1)=A×367.7。
2.3 统计处理方法溶血指标的检查结果统计采用百分率表示；所有试验均重复3次。试验数据用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，统计结果以x± s 表示。
3 结果 3.1 体外溶血试验结果结果表明，灰毡毛忍冬花蕾提取物(hH)、灰毡毛忍冬皂苷乙(mB)与川续断皂苷乙(dB)的各浓度体外溶血试验中，均未观察到溶血现象；各给药组致体外红细胞溶血率均低于5%,也无明显的剂量依存关系。见Tab 1、2、3。按照《中药、天然药物局部刺激性和溶血性研究技术指导原则》的判定标准，体外红细胞溶血率低于5%说明无溶血发生[13]。
| No | Group | Detected solution/mL | Hemolysis Results | Absorbance | Hemolysis ratio/% | |||
| hH | 2%RBC | NS | DH2O | |||||
| 1 | Negative | 0 | 2.5 | 2.5 | 0 | - | 0.046 | 0.0 |
| 2 | Positive | 0 | 2.5 | 0 | 2.5 | + | 0.754 | 100 |
| 3 | 5 mg·L-1 hH | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.042 | 0.0 |
| 4 | 10 mg·L-1 hH | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.046 | 0.0 |
| 5 | 20 mg·L-1 hH | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.050 | 0.5 |
| 6 | 30 mg·L-1 hH | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.051 | 0.5 |
| 7 | 40 mg·L-1 hH | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.053 | 0.9 |
| 8 | 50 mg·L-1 hH | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.045 | 0.0 |
| 9 | 60 mg·L-1 hH | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.048 | 0.1 |
| 10 | 70 mg·L-1 hH | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.071 | 3.3 |
| 11 | 80 mg·L-1 hH | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.067 | 2.9 |
| 12 | 90 mg·L-1 hH | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.074 | 3.9 |
| 13 | 100 mg·L-1 hH | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.066 | 2.8 |
| “+”shows that the test solution was transparent red，and there was no or just a few RBC fragments in the bottom of test tube，which suggesting hemolyses occurred;“-”shows that all RBCs sank，the supernatant liquid is colorless transparent，suggesting no hemolyses occured | ||||||||
| No | Group | Detected solution/mL | Hemolysis Results | Absorbance | Hemolysis ratio/% | |||
| mB | 2% RBC | NS | DH2O | |||||
| 1 | Negative | 0 | 2.5 | 2.5 | 0 | - | 0.040 | 0.0 |
| 2 | Positive | 0 | 2.5 | 0 | 2.5 | + | 0.818 | 100 |
| 3 | 5 mg·L-1 mB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.039 | 0.0 |
| 4 | 10 mg·L-1 mB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.047 | 0.8 |
| 5 | 20 mg·L-1 mB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.045 | 0.6 |
| 6 | 30 mg·L-1 mB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.050 | 1.2 |
| 7 | 40 mg·L-1 mB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.049 | 0.5 |
| 8 | 50 mg·L-1 mB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.047 | 0.8 |
| 9 | 60 mg·L-1 mB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.044 | 0.8 |
| 10 | 70 mg·L-1 mB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.057 | 2.1 |
| 11 | 80 mg·L-1 mB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.067 | 3.4 |
| 12 | 90 mg·L-1 mB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.066 | 3.3 |
| 13 | 100 mg·L-1 mB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.062 | 2.8 |
| “+”shows that the test solution was transparent red，and there was no or just a few RBC fragments in the bottom of test tube，which suggesting hemolyses occurred;“-”shows that all RBCs sank，the supernatant liquid is colorless transparent，suggesting no hemolyses occured | ||||||||
| No | Group | Detected solution/mL | Hemolysis Results | Absorbance | Hemolysis ratio/% | |||
| dB | 2% RBC | NS | DH2O | |||||
| 1 | Negative | 0 | 2.5 | 2.5 | 0 | - | 0.040 | 0.0 |
| 2 | Positive | 0 | 2.5 | 0 | 2.5 | + | 0.757 | 100 |
| 3 | 5 mg·L-1 dB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.024 | 0.0 |
| 4 | 10 mg·L-1 dB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.022 | 0.0 |
| 5 | 20 mg·L-1 dB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.046 | 0.8 |
| 6 | 30 mg·L-1 dB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.046 | 0.8 |
| 7 | 40 mg·L-1 dB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.053 | 1.8 |
| 8 | 50 mg·L-1 dB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.060 | 2.7 |
| 9 | 60 mg·L-1 dB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.062 | 3.0 |
| 10 | 70 mg·L-1 dB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.058 | 2.5 |
| 11 | 80 mg·L-1 dB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.049 | 1.3 |
| 12 | 90 mg·L-1 dB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.061 | 2.9 |
| 13 | 100 mg·L-1 dB | 0.3 | 2.5 | 2.2 | 0 | - | 0.067 | 3.7 |
| “+”shows that the test solution was transparent red，and there was no or just a few RBC fragments in the bottom of test tube, Which suggesting hemolyses occurred;“-”shows that all RBCs sank，the supernatant liquid is colorless transparent，suggesting no hemolyses occured | ||||||||
灰毡毛忍冬花蕾提取物(hH)、灰毡毛忍冬皂苷乙(mB)与川续断皂苷乙(dB)的体内溶血试验表明，供试物对小鼠血液学指标无明显影响，给药前与给药后各组小鼠的红细胞数、网织红细胞数、血红蛋白含量平均值均在正常范围(红细胞数：7.7~12.5×1012·L-1；网织红细胞数：2.15%~5.87%； 血红蛋白：100~210 g·L-1)[16]，见Tab 4。
| (x± s ，n=10) | ||||||
| Group | RBC/1012·L-1 | RET/% | MCHC/g·L-1 | |||
| pre-dose | post-dose | pre-dose | post-dose | pre-dose | post-dose | |
| NS | 9.37±0.47 | 9.45±0.39 | 2.88±0.61 | 2.78±0.93 | 202.36±9.33 | 193.45±9.29 |
| hH 2.275 g·kg-1 | 8.87±0.87 | 8.57±0.47 | 3.22±0.45 | 3.12±0.34 | 185.83±18.82 | 170.46±20.98 |
| hH 1.137 g·kg-1 | 9.06±0.87 | 8.63±0.63 | 3.16±0.42 | 3.23±0.51 | 157.37±18.29 | 159.43±19.06 |
| mB 0.110 g·kg-1 | 9.22±0.47 | 8.72±0.92 | 2.69±0.43 | 2.75±0.37 | 167.96±10.56 | 166.71±12.69 |
| mB 0.055 g·kg-1 | 10.37±0.55 | 8.40±0.90 | 2.75±0.33 | 2.84±0.28 | 178.37±11.68 | 156.64±11.62 |
| dB 0.020 g·kg-1 | 8.86±0.75 | 8.51±0.41 | 2.91±0. 52 | 2.88±0.34 | 173.95±8.84 | 170.35±18.85 |
| dB 0.010 g·kg-1 | 8.58±0.64 | 8.32±0.57 | 3.38±0.37 | 2.98±0.42 | 160.86±19.15 | 168.68±14.35 |
皂苷导致溶血，多是因为皂苷能与胆固醇结合生成不溶性的分子复合物[17]。当皂苷水溶液与红细胞相接触时，红细胞壁上的胆固醇与皂苷结合，生成不溶性的复合物沉淀，血红细胞的正常渗透性遭到破坏，使红细胞内渗透压增加而发生崩解，从而导致溶血现象[18]。皂苷溶血活性还和糖链数目有关，许多双糖链皂苷无溶血作用，但单糖链皂苷溶血作用明显[19]。但并非所有皂苷都具有溶血现象，例如以含三萜皂苷为主的人参总皂苷没有溶血作用，但经过分离后，其中以原人参三醇及齐墩果酸为苷元的人参皂苷则具有明显的溶血作用，而以人参二醇为苷元的人参皂苷则具有抗溶血作用[17]。另外，皂苷的溶血性也与皂苷中所含基团酸碱性有关，酸性皂苷溶血作用大于中性皂苷[20, 21]。灰毡毛忍冬皂苷乙与川续断皂苷乙均为常春藤皂苷元的双糖链皂苷，理论上不具有溶血作用。
4.2 有关“灰毡毛忍冬皂苷具有溶血作用”问题查无实据历史的有关报道并没有涉及到皂苷问题。1984年贵州省药材公司王玉英等在《中药材科技》第2期报道有关研究结果的全文如下“① 五种材料的LD50顺序为: 密银花 < 济银花 < (灰毡毛忍冬)蒸晒品 < (灰毡毛忍冬)生晒品 < 贵州商品。可见灰毡毛忍冬的毒性虽较密银花、济银花稍大,但蒸晒品或生晒品均小于贵州山银花,因而是安全的。② 灰毡毛忍冬蒸晒品无溶血性,而生晒品有溶血性。如作注射液原料,必须采用蒸晒。③ 对灰毡毛忍冬的蒸晒品与生晒品进行比较,前者的毒性比后者小；前者无溶血性而后者有溶血性。故产地加工应采用蒸晒法。”该文主要强调加工规范，没有将灰毡毛忍冬的两种皂苷与溶血性相联系，没有进行任何成分、机制方面的研究。近30年来也未见类似报道，有关灰毡毛忍冬皂苷具有溶血作用的问题查无实据。
4.3 本试验结果未发现灰毡毛忍冬及其两种主要皂苷的溶血作用本研究采用山银花野生资源保护地，亦是山银花最大种植加工生产地——重庆秀山所产灰毡毛忍冬为研究对象。该县自2006年以来在全县推广使用特别研制的银花产地加工“蒸汽杀青热风干燥机”，目前有蒸汽杀青热风干燥机148台覆盖全县30.1万亩种植基地，药材加工规范，质量统一，具有代表性。本研究以《中药、天然药物刺激性和溶血性研究的指导原则》为规范，进行了体外试验，分光光度法与肉眼观察法结果均表明，灰毡毛忍冬花蕾提取物、灰毡毛忍冬皂苷乙与川续断皂苷乙在一定浓度范围内(5～100 mg·L-1)均没有溶血作用，且查阅文献未发现有报道三萜皂苷溶血作用与浓度有关。在模拟溶血反应长期毒性试验方法进行给药7 d的体内溶血试验中，各给药组给药前后红细胞数、网织红细胞数、血红蛋白含量均处于正常范围内[16]，且各组给药前后的数值没有差异性(P>0.05)。由此得出，经产地蒸汽杀青后干燥(或蒸晒法)加工制成的灰毡毛忍冬花蕾混合提取物，以及灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙均不会导致溶血。
(致谢：本试验在西南大学药学院分子药理实验室、重庆市药效评价工程技术研究中心和西南大学中药研究所完成。感谢实验室各位老师的帮助与支持！)
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