肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)发病的核心事件是肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)紧张性增强、过度增殖和凋亡不足而引起的肺动脉收缩加强和血管重构^[1]。在PAH发病过程中，Ca²⁺因能同时影响PASMCs的收缩、增殖和凋亡而成为PAH研究的热点之一。最近发现，钙池操纵性钙通道(store-operated calcium channel,SOCC)对细胞内钙的稳态起重要的调节作用，SOCC是由经典瞬间受体电位(TRP Canonical，TRPC)亚家族和Orai家族组成的异多聚体蛋白，受内质网钙池感受器基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)调控^[2]。我们前期研究发现PAH动物模型上存在SOCC表达和功能的上调，而且这种上调参与了PAH的发病^{[3, 4, 5]}。由于STIM1可调节多种正常细胞和肿瘤细胞的增殖^{[6, 7]}，我们推测STIM1可通过调节血管平滑肌细胞增殖而影响PAH发生，但目前相关研究尚少见报道。本研究首先建立肺动脉高压动物模型，检测STIM1蛋白和mRNA的表达，随后在培养的动脉平滑肌细胞中过表达STIM1，观察其对细胞增殖以及对Akt/mTOR增殖信号途径的影响，拟探讨STIM1对平滑肌细胞增殖的影响及可能的机制，为PAH防治提供新靶点。

SD大鼠，♂，体质量160~180 g，福州吴氏实验动物有限公司；动脉平滑肌细胞A7R5，中国科学院上海细胞库；胎牛血清，Hyclone公司；F-12培养基、青链霉素、TRIzol，Invitrogen公司；胶原酶、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白、野百合碱(MCT)、HEPES、D-葡萄糖、抑肽酶、正钒酸钠，Sigma公司；Rvert Aid First Strand cDNA合成试剂盒，Thermo Fermentas公司；X-tremeGENE HP DNA转染试剂、SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒，罗氏公司；兔抗STIM1抗体，Alomone Labs公司；兔抗β-actin、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、p70-S6K、p-p70-S6K、4E-BP1、p-4E-BP1抗体及第二抗体，Cell Signaling公司；CCK-8试剂盒，同仁化学研究所；蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液、PMSF、抗体稀释液、ECL发光试剂盒，碧云天生物技术研究所；质粒pEX-SP-YFP-STIM1及对照质粒购自Addgene，经本实验室测序验证。其余试剂均为进口或国产分析纯。

健康SD大鼠，♂，体质量160~180 g，随机分成正常对照组(CON组)和MCT模型组(MCT组)。CON组：SD大鼠正常饲养3周，MCT组：按60 mg·kg^-1剂量一次性腹腔注射2% MCT，正常饲养3周。

CON组和MCT组大鼠分别腹腔注射肝素(Heparin,50 IU/100 g)，在5 min后氨基甲酸乙酯(1 g·kg^-1)腹腔麻醉，从右颈外静脉插管直到右心室，记录大鼠RVSP。测完RVSP后，迅速开胸取出心脏及肺。沿房室交界处剪去左右心房及大血管，分离右心室(RV)及左心室+室间隔(LV+S)，用滤纸吸去多余水分，分别称重，计算RV/(LV+S)即RVMI。

将取下的左肺用大头针固定在泡沫板上，在距离肺尖约0.5 cm处切取肺组织，肺组织在负压中性甲醛中固定24 h、石蜡切片、HE染色。光镜下观察CON和MCT组的肺血管形态。

对照组大鼠和模型组大鼠的肺动脉标本在液氮中充分研磨后， 用TRIzol试剂提取RNA，实时定量PCR技术测定STIM1基因表达水平(18S rRNA引物：5′-GTCTGTGATGCCCTTAGATG-3′，5′-AGCTTATGACCCGCACTTAC-3；STIM1引物： 5′-GAGCACCGAACAGTGGAAGT-3，5′-GCCTCTCTGCATTTTGCTTC-3′)。肺动脉标本以RIPA细胞裂解液(含1 mmol·L^-1 PMSF、1 mmol·L^-1正钒酸钠、10 mg·L^-1抑肽酶)提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，取40 μg总蛋白进行Western blot实验，测定STIM1蛋白表达水平。

A7R5细胞于F-12培养基(含10%胎牛血清和1%青链霉素)、在5% CO₂和37 ℃下正常培养。细胞按合适的比例接种6孔板中，每孔加培养液2 mL，培养约24 h，使细胞生长的汇合度在95%左右。参照X-tremeGENE HP转染试剂说明书进行转染实验，简述如下：配制X-tremeGENE HP转染试剂工作液并按一定比例与配好的0.01 g·L^-1质粒溶液混合，在15℃~25℃下孵育15 min；取出细胞，无需弃去生长培养基，将转染混合物滴加至细胞中，轻柔振荡混匀后，37 ℃培养72 h后，提取总蛋白，采用Western blot技术测定STIM1蛋白表达量。实验分组：① 空白组：仅加转染试剂，不加质粒；② 对照组：加入空质粒；③ 实验组：加入STIM1过表达质粒。

转染72 h后，收集对照组和实验组细胞，制成适当浓度的单细胞悬液(5×10⁷·L^-1)，接种至96孔板，每孔100 μL。每组细胞设5个复孔，37 ℃和5% CO₂实验条件下常规培养。于接种后d 1、2、3、4、5各取出一块96孔板进行检测。每孔加入CCK-8 10 μL，37℃培养1 h后，酶标仪上检测450 nm处的光吸收度，以培养时间为横坐标，A₄₅₀为纵坐标绘制细胞生长曲线。实验重复3次。

转染72 h后，收集各组细胞，PBS洗2次，加入RIPA细胞裂解液(含1 mmol·L^-1 PMSF、1 mmol·L^-1正钒酸钠、10 mg·L^-1抑肽酶)提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，取40 μg总蛋白进行Western blot实验。10% SDS-PAGE电泳后行转膜印迹，分别用各种第一抗体与膜上的抗原结合，然后用HRP偶联的二抗与其反应，用ECL化学发光试剂检测，经压片曝光后，显影和定影。采用Phoretix 1D V2003.03图像分析软件测定和比较各组蛋白表达情况。

所有数据均采用SPSS软件进行统计学处理，实验数据以x± s 表示，组间比较采用t检验。

腹腔注射MCT 3周后，MCT组的RVSP明显高于CON组[(57.4±10.3) mmHg vs (18.1±3.8) mmHg,P < 0.01](1 mmHg=0.133 kPa)，而MCT组的平均体循环动脉压(mean systemic arterial pressure，mSAP)与CON相比没有明显差异[(102.4±12.1) mmHg vs (104.8±10.1) mmHg,P>0.05]，提示右心室内压增高；MCT组的RVMI明显高于CON组[(53.0±9.2)% vs (29.5±4.8)%,P < 0.05]，表明右心重构、肥大，提示慢性PAH大鼠模型成功建立，见Fig 1A~D。

Fig 1 Characterization of MCT-induced rat pulmonary hypertension model The primitive RVP curve in CON (A) and MCT(B). MCT-induced increases in right ventricle systolic pressure (RVSP, P<0.01 vs CON) (C) and RVMI(RV/LV+S, *P < 0.05 vs CON) (D). The Representative section (HE stain) of pulmonary arteries from CON (E) and MCT (F) rats;1 mmHg=0.133 kPa.

图选项

镜下可见CON组的气管上皮完整，软骨片缺如，气管外包绕一层平滑肌，与其伴行的肺动脉内皮完整，中膜由一层平滑肌组成。MCT组气管上皮完整，软骨片亦缺如，气管外包绕一层平滑肌，与其伴行的肺动脉内皮完整，可见中膜由一层平滑肌组成。与CON组中外径相近的肺小动脉相比，MCT组肌壁明显增厚伴玻璃样变，管腔狭窄甚至闭塞，内膜纤维化，出现了肺血管重构，说明MCT能使肺动脉平滑肌增生肥厚，见图 1 E~F。

以实时定量PCR和Western blot法分别检测野百合碱诱导大鼠肺动脉高压模型中STIM1 mRNA和蛋白质相对于正常大鼠的表达，结果显示，模型组STIM1 mRNA和蛋白的表达量分别是对照组的(2.19±0.49)和(1.66±0.32)倍，两者相比 差异存在显著性，见Fig 2。

Fig 2 Expression of STIM1 in pulmonary arteries of MCT-induced hypertensive rat A： STIM1 mRNA expressions in control and MCT-treated rats；B： STIM1 protein expressions in control and MCT-treated rats; C: Bar figure of STIM1 protein expressions, **P < 0.01 vs control.

图选项

转染STIM1质粒明显增加A7R5的STIM1蛋白表达，Western blot结果出现明显的STIM1-YFP融合蛋白条带，而空质粒转染组无此条带，见Fig 3。细胞生长曲线结果显示：培养的A7R5在d 2开始增殖，d 3开始进入对数生长期，STIM1转染组与对照组相比，细胞的生长速度加快，说明所得到的STIM1高表达可促进细胞增殖，见Fig 3。

Fig 3 Effects of STIM1 overexpression on A7R5 cells proliferation A： Overexpression of STIM1 in arterial smooth muscle cells A7R5； B: Effects of STIM1 overexpression on A7R5 cells proliferation, *P < 0.05 vs control.

图选项

Western blot结果显示，转染STIM1可明显增加p-Akt、p-mTOR、p-p70-S6K、p-4E-BP1的表达，而对Akt、mTOR、p70-S6K和4E-BP1的表达没有影响，见Fig 4。

Fig 4 Effects of STIM1 overexpression on Akt-mTOR signaling

图选项

MCT是一种双吡咯类生物碱，在肝脏内经酶的作用后形成野百合碱吡咯(MCTP)，沉积于肺小动脉壁和肺毛细血管，导致肺血管内皮发生广泛、不可逆性损伤，导致肺动脉高压，能很好的模拟急进型PAH的发生过程^[8]。本研究显示，大鼠腹腔注射MCT模型组RVSP相比正常组大鼠明显升高(P < 0.05)。HE染色结果显示肺动脉肌壁明显增厚，管腔狭窄甚至闭塞，内膜纤维化；小血管壁未见正常结构并有纤维素样渗出，管周有炎症细胞大量浸润，结合大鼠一系列肺动脉高压症状的出现，提示成功建立肺高压大鼠模型。

动脉平滑肌细胞膜上的钙池操纵性钙通道(SOCC)参与了细胞内Ca²⁺稳态的维持，对动脉平滑肌的收缩和增殖起重要作用。它是由经典瞬间受体电位(TRP Canonical，TRPC)亚家族和Orai家族组成的异多聚体蛋白，受内质网钙感受器STIM1调控，当内质网腔Ca²⁺充盈时，STIM1在内质网膜上均匀分布；Ca²⁺池耗竭使STIM1在内质网上形成多聚体，作用于质膜上TRPC/Orai复合体，触发SOCC开放。我们前期发现，在慢性缺氧和MCT诱发的PAH大鼠模型上，SOCC膜通道的组分之一TRPC1在PASMCs的表达上调^{[3, 4]}，提高SOCC介导的Ca²⁺内流，引起PASMCs的静息[Ca²⁺]_i升高和基础张力增加；耗竭细胞Ca²⁺池可激活Ca²⁺内流和血管收缩，SOCC抑制剂(Gd³⁺、La³⁺、SKF-96365)不仅抑制SOC介导的钙内流，也抑制内皮素引起的血管收缩^{[3 ,5]}。这些结果提示，PAH动物模型存在SOCC功能的上调。

为确定PAH动物是否存在SOCC关键分子STIM1表达上调，本研究采用实时PCR和Western blot法分别检测MCT诱导大鼠肺高压模型中STIM1 mRNA和蛋白质相对于正常大鼠的表达，结果显示，MCT诱导产生的肺高压大鼠肺动脉组织的STIM1 mRNA和蛋白质表达水平均明显高于对照大鼠，证实肺高压模型上存在STIM1的表达上调。Soboloff等^[9]测定了过表达STIM1、Orai1对HEK293细胞钙池操纵性钙内流(store-operated calcium entry,SOCE)的影响，发现单独过表达STIM1可适度增加SOCE(2~3倍)，单独过表达Orai1可明显抑制SOCE(下降至30%~40%)，而共表达STIM1、Orai1可大幅度增加SOCE(20~30倍)。本研究室前期测定了MCT肺高压大鼠模型中Orai1的表达，发现Orai1表达明显增加(另文发表)。因此，本研究中模型组大鼠肺动脉STIM1表达的上调，可与Orai1的增加形成协同效应，导致肺动脉SOCE的增高。

对多种肿瘤或正常细胞的研究显示，SOCE及其主要成分STIM1与细胞增殖密切相关^{[10, 11]}。本研究中，为探讨STIM1对动脉平滑肌细胞增殖的影响，我们在体外培养的动脉平滑肌细胞A7R5上建立STIM1瞬时高表达模型，观察其对细胞增殖的影响。结果显示，过表达STIM1可促进A7R5的增殖，这一结果说明，模型大鼠肺动脉组织STIM1高表达可促进动脉平滑肌细胞增殖，可能对肺动脉高压形成起促进作用。Potier等^[12]采用RNAi技术在A7R5上抑制STIM1和Orai1的表达，发现可大幅度降低SOCE，并抑制A7R5细胞的增殖和迁移，与我们的结果是一致的。

PI3K/Akt/mTOR途径是调节细胞增殖的重要信号通路，多种生长因子可激活PI3K/Akt信号，进而激活mTOR复合物，增强细胞能量代谢及蛋白质、脂类合成，促进细胞生长^[13]。研究显示，mTOR因能促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，对PAH的发病起到促进作用^{[14, 15]}。刘杰等^[16]采用雷帕霉素对MCT诱导的PAH大鼠进行实验性治疗，发现与野百合碱组相比，雷帕霉素干预组大鼠右心室收缩压明显改善，右心室肥厚指数明显降低，肺动脉重构程度明显减轻，证明mTOR在肺动脉高压发病中起重要作用。

本研究在动脉平滑肌细胞A7R5中过表达STIM1，观察STIM1对Akt/mTOR信号途径的调节，结果显示，Akt和mTOR磷酸化水平增加而蛋白质水平不变，提示Akt/mTOR途径活化。P70S6K和4E-BP1是mTOR的直接底物，其磷酸化水平常用于判断mTOR的活化，本研究发现STIM1过表达可增强p70S6K和4E-BP1的磷酸化，证明了STIM1可促进mTOR的活化，这可能与肺动脉高压发病中PASMCs增殖能力增强有关。Selvaraj等^[17]在帕金森病的细胞模型上的研究发现，过表达STIM1/TRPC1，可升高神经细胞的钙池操纵性Ca²⁺内流，并进而激活Akt/mTOR途径，促进细胞生存和对抗神经毒素MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)的能力。Selvaraj等^[18]的另一项研究发现，白藜芦醇可抑制STIM1并进而抑制mTOR途径，诱导前列腺癌细胞死亡，而过表达STIM1可增强mTOR磷酸化，抑制内质网应激和细胞死亡。这些结果说明，STIM1对Akt/mTOR的调节可能是多种细胞都存在的普适性的调节机制。

综上所述，我们在MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型中，观察到了SOCC关键分子STIM1的mRNA和蛋白质的高表达；在大鼠动脉平滑肌细胞A7R5中过表达STIM1，发现细胞增殖能力增强和Akt/mTOR途径活化。这些结果提示，在PAH发病过程中，STIM1可能通过上调Akt/mTOR信号，促进PASMCs增殖和PAH发生。STIM1调节MCT诱导的肺高压发病的确切机制，以及在其他肺动脉高压大鼠模型中的作用仍在进一步研究中。

(致谢：本文在福建医科大学基础医学院心血管研究室完成，特此致谢！)