免疫性肝损伤 (immunological liver injury,ILI)是肝脏纤维化、肝硬化甚至肝癌等肝脏严重病变前期的发展过程，由生物性因素(病毒等)引起，导致以IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-6等炎症因子异常(免疫反应)为基础的肝脏损伤^[1]。中药复方在治疗肝脏疾病方面已有上千年的历史，Chien等^[2]报道其是一种很有希望治疗肝脏疾病的方法。早在东汉《伤寒论》中就有记载栀子柏皮汤这一复方汤剂，其主要用于发黄、湿热等伤寒症，由栀子、黄柏和甘草组成^[3]。肖旭等^[4]在研究中发现栀子柏皮汤对于急性肝损伤小鼠模型中有一定的保肝作用。但现有研究对栀子柏皮汤及配伍组在保肝护胆方面的研究较多，大多数都是针对于化学药物(如CCL₄)所致的急性肝损伤，但对其在由生物素(如ConA)引起的免疫性肝损伤方面研究较少。本研究通过建立小鼠免疫性肝损伤模型(将ConA尾静脉注射)^[4] 观察小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、ALT和AST含量，栀子柏皮汤及其含栀子配伍组对肝匀浆中MDA含量、SOD活性以及NF-κB-p65、NF-κB-p-p65蛋白的表达水平的影响，观察栀子柏皮汤及各含栀子配伍组保肝作用的差异性，研究其在保护免疫性肝损伤的可能作用机制。

安徽医科大学第一附属医院药剂科提供栀子、黄柏、甘草。全方组：栀子、黄柏、甘草分别取 100、60和30 g，第一次煎煮加10倍于药材量的水量，直至沸腾后30 min，过滤后保存液体，药材第二次煎煮时加8倍于药材量的水量，直至沸腾后30 min，过滤后保存液体，两次煎煮后所得滤液混合后用低温旋转蒸发仪将其浓缩至合原生药量的1 g·mL^-1，保存于4 ℃。栀子单煎液：取栀子100 g，使用以上方法煎煮制成1 g·mL^-1浓缩液，保存于4 ℃。栀子+黄柏、栀子+甘草配伍组制备: 其中，栀子+黄柏组: 取栀子100 g，黄柏60 g; 栀子+甘草组: 取栀子100 g，甘草30 g。使用以上方法煎煮制成1 g·mL^-1浓缩液，保存于4 ℃。

清洁级ICR小鼠70只，♂♀各半，体质量为18~22 g，由安徽医科大学实验动物中心提供。实验期间室温(25±2)℃。

刀豆蛋白(ConA) 购自美国 Sigma 公司；强的松(醋酸泼尼松片)购自浙江仙琚制药股份有限公司； ALT、AST、MDA、SOD试剂盒均购自南京建成生物有限公司; IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-6 ELISA试剂盒均购自上海源叶公司； NF-κB-p65及NF-κB-p-p65多克隆抗体均购自美国 Santa Cruz 公司; 辣根酶标记山羊抗兔/小鼠IgG 购自北京博奥森公司。

将ICR小鼠70只，♂♀各半，随机分为A(正常组)、B(模型组)、C(栀子组)、D(栀子甘草组)、E(栀子黄柏组)、F(栀子柏皮汤全方组)、G(强的松阳性药对照组)(以下图示中均用字母代替组别)。而正常组和模型组的小鼠灌胃给予等体积生理盐水，相应制备汤剂用于其他各组，所有小鼠连续7 d预防灌胃后，各组按照20 mg·kg^-1的量尾静脉注射Con A制备免疫性肝损伤模型(除正常组小鼠)，禁食禁水。8 h后，通过眼球取血，并对小鼠安乐死，分离肝脏和脾脏，称重，计算肝、脾指数。

计算公式为：肝脏指数=肝脏重量/(小鼠体重×20);脾脏指数=脾脏重量/(小鼠体重×20);(20代表20g小鼠的肝脾指数)

取相同部位的肝脏组织，用多聚甲醛进行固定，包埋。进行HE染色，观察肝脏组织形态学变化情况。

采集到的血液样品在4 ℃冰箱中放置过夜，于次日4℃、3 000×g，20 min，得到上清(血清)。采用试剂盒(微板法)检测ALT与AST的活性。

利用0.154 mol·L^-1 NaCl 溶液为溶剂将取出的肝脏标本制备成肝匀浆，4℃、3 000×g，15 min，取上清。采用试剂盒(微板法)检测MDA含量及SOD活性。

用含PMSF的 RIPA蛋白裂解液进行组织蛋白提取，后利用NanoDrop 2000 蛋白定量仪进行蛋白定量，按4 ∶1的比例加入5×蛋白上样buffer，煮沸变性10 min。使用SDS-PAGE胶，然后湿转至0.45 μm的PVDF 膜上，加入目的蛋白NF-κB-p65及NF-κB-p-p65和内参蛋白 β-actin 的一抗 4℃ 孵育过夜，通过辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测，利用ECL 化学发光剂进行曝光成像，Image-Pro Plus图像处理系统测定的分析结果。

采用SPSS 17.0软件进行分析，现将各组数据进行方差齐性检验后，在采用One-Way ANOVA检验方法进行组间比较。

正常组小鼠给药期间未出现疾病状况(饮食活动均正常)。在尾静脉注射ConA造模后的8 h内，发现模型组小鼠与正常组小鼠相比，活动明显减少，饮水活动明显减少(已经禁食)，但无小鼠死亡。

如Fig1所示，正常组小鼠肝脏未观察到明显异常，可观察到细胞核大小正常并可见核质淡染，肝细胞质均呈现红染，汇管区无炎细胞浸润，结构清晰。模型组中肝组织内可观察到大量炎性细胞浸润，特别是少量的淋巴细胞、粒细胞存在于汇管区，肝窦间隙明显增宽，有的还可见点状坏死,嗜酸性改变,核变大。栀子柏皮汤及各含栀子配伍组预处理后均能不同程度地减轻肝脏炎症坏死的程度，改善小鼠肝脏病理损伤，尤其以栀子柏皮汤全方组保护作用最为明显。

Fig 1 HE staining was conducted and examined under microscopy (×200). A:Control;B:Model group;C:Zhizi group;D:Zhizi Gancao group;E:Zhizi Huangbai group;F:Zhizi Baipi Soup group;G:Positive control group

图选项

如Fig2所示。相比于正常组小鼠，模型组小鼠肝脾指数明显升高(P < 0.01，P < 0.05)，而相比于与模型组小鼠，C(栀子组)、D(栀子甘草组)、E(栀子黄柏组)、F(栀子柏皮汤全方组)以及G(强的松阳性药组)小鼠肝脾指数明显降低(P < 0.01，P < 0.05)，尤其以栀子柏皮汤全方组降低最为明显。

Fig 2 Liver index and spleen index were calculated and listed( ± s) Note see Fig 1. **P < 0.01 vs A group; #P < 0.05，##P < 0.01 vs B group.

图选项

如Fig3所示，相比于正常组小鼠，模型组AST、ALT水平异常升高(P < 0.01)。而相比于与模型组小鼠，C(栀子组)、D(栀子甘草组)、E(栀子黄柏组)、F(栀子柏皮汤全方组)以及G(强的松阳性药组)小鼠血清中AST、ALT水平明显降低(P < 0.01，P < 0.05)，尤其以栀子柏皮汤全方组降低最为明显。

Fig 3 AST and ALT production was measured by detection kit( ± s) Note see Fig1. ConA injection dramatically increased serum AST and ALT, whereas Zhizi Baipi Soup and its disassembled prescription containing Zhizi pretreatment significantly attenuated these increases of both serum AST and ALT levels as compared with model group. **P < 0.01 vs A group, ##P < 0.01 vs B group.

图选项

如Fig4所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠肝匀浆上清液中MDA水平明显升高，SOD水平明显降低(P < 0.01)。与模型组相比，C(栀子组)、D(栀子甘草组)、E(栀子黄柏组)、F(栀子柏皮汤全方组)以及G(强的松阳性药组)小鼠肝匀浆上清液中MDA水平明显降低，SOD水平明显升高(P < 0.01，P < 0.05)。

Fig 4 MDA and SOD production were measured by detection kit( ± s) Note see Fig1. **P < 0.01 vs A group; #P < 0.05，##P < 0.01 vs B group.

图选项

如Fig5所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠血清中TNF-α和IFN-γ水平明显升高，IL-4和IL-6水平明显降低(P < 0.01)。与模型组小鼠相比，C(栀子组)、D(栀子甘草组)、E(栀子黄柏组)、F(栀子柏皮汤全方组)以及G(强的松阳性药组)小鼠血清中IFN-γ和TNF-α水平明显降低，IL-4和IL-6水平明显升高(P < 0.01，P < 0.05)。

Fig 5 IFN-γ, TNF-α, IL-4 and IL-6 production were measured by ELISA assay( ± s) Note see Fig1. **P < 0.01 vs A group; ##P < 0.01 vs B group.

图选项

如Fig6所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠的NF-κB-p65的表达水平明显升高(P < 0.01)。与模型组小鼠相比，C(栀子组)、D(栀子甘草组)、E(栀子黄柏组)、F(栀子柏皮汤全方组)以及G(强的松阳性药组)小鼠NF-κB-p65和NF-κB-p-p65的表达水平明显降低(P < 0.01，P < 0.05)。

Fig 6 NF-κB-p65 and NF-κB-p-p65 expression were measured by Western blot( ± s) Note see Fig1. Western blot analysis showed that Zhizi Baipi Soup and its disassembled prescription containing Zhizi inhibited expression of NF-κB-p65 and NF-κB-p-p65 protein;**P < 0.01 vs A group; ##P < 0.01 vs B group.

图选项

目前，机体免疫应答反应介导的肝组织损伤已经成为众多肝脏疾病发生发展的重要原因之一。ConA是一种能活化T淋巴细胞并且可在体外激活T细胞的丝裂原，从而导致免疫性肝脏损伤的植物凝集素，特异性地靶向人体内肝细胞产生毒性作用。ConA诱发的小鼠急性肝损伤是近年来经典的免疫性肝损伤小鼠模型^[4]，其损伤机制主要是通过激活肝窦内存在的巨噬细胞，产生细胞因子TNF-α，TNF-α的产生可以直接对肝细胞产生损害作用，从而导致肝细胞凋亡和坏死^{[5, 6]}。不仅如此，ConA诱发的小鼠免疫性肝损伤使大量的IFN-γ和活化的T细胞进入肝脏，从而破坏与接触的肝细胞和激活巨噬细胞导致肝脏损伤^[7]。本实验证实，栀子柏皮汤和含栀子的配伍组都可以保护肝组织免于ConA诱发的小鼠免疫性肝损伤，同时，降低肝脾指数和小鼠血清中 ALT、AST 及肝组织中 MDA 的水平，提高SOD的活性，提示在复方中的君药栀子在保肝中发挥积极的重要作用，张海燕等^[8]也证明了这一观点。并且实验结果突出了栀子柏皮汤全方组降低小鼠血清 ALT、AST 水平及肝组织 MDA 水平效果最佳，强于其他各含栀子配伍组药，同时SOD的水平也被明显升高。证实了栀子柏皮汤中各组分是通过协同作用发挥保肝的，另外，病理学也验证了这一结果。

辅助性T细胞(Th0)能够调节体内的免疫应答反应，在不同环境下可分化为Th1型和Th2型。在免疫应答调节中，Thl/Th2极化是一个非常关键的环节。其中，Th0向Thl型分化可通过IFN-γ、TNF-α诱导，而向Th2型分化则由IL-4、IL-6刺激，说明细胞炎症因子能够通过T细胞的分化影响体内免疫反应^[9]。Thl型细胞因子如IFN-γ等诱导靶细胞引起的细胞吞噬作用来发挥调节体内免疫反应；Th2型细胞因子能够刺激B淋巴细胞产生特异性抗体，如IL-4、IL-6。本实验中，与模型组比较，栀子柏皮汤及各含栀子配伍组可明显降低血清TNF-α、IFN-γ的水平，升高IL-6、IL-4的分泌水平，提示栀子柏皮汤及各含栀子配伍组能够下调T0向Thl转化，加强向Th2的分化，也就是可以调节并恢复Th1/Th2在体内的平衡，能够改善和保护肝组织损害程度，其中栀子柏皮汤全方组保护作用最明显。

核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是由p65和p50构成的异二聚体。正常情况下，NF-κB-p65位于胞质中；疾病过程中p65被磷酸化，p-p65进入细胞核，从而调控原癌基因表达。p-p65在各种肝脏疾病(如免疫性肝损伤和肝癌等)发展过程中均处于激活状态，对治疗肝脏疾病具有明显的作用^[10]。NF-κB能结合众多炎症介质和细胞因子的启动子，激活其表达，促进机体的免疫和炎症反应。有证据证明，TNF-α、IL-6等是NF-κB的结合位点，被NF-κB调控^[11]。值得注意的是，NF-κB能够明显激活炎性细胞因子，同时又被作为激动剂的炎性细胞因子激活，从而形成一个恶性循环，加剧机体内的免疫反应。抑制p-p65的表达被作为调节体内免疫反应的一个重要的指标。Western blot发现，模型组p-p65的表达水平与正常组比较明显升高。与模型组比较，栀子柏皮汤及各含栀子配伍组NF-κB-p65的水平明显降低，其中栀子柏皮汤全方组降低最为明显。说明栀子柏皮汤及各含栀子配伍组能明显阻断NF-κB-p65的表达，并提示柏皮汤全方组较其他各含栀子配伍组能更好抑制免疫抑制反应，从而保护肝脏功能。

综上所述，栀子柏皮汤及各含栀子配伍组对ConA诱导的小鼠免疫性肝损伤有一定的保护作用，并且栀子柏皮汤全方组的保护作用最为明显，其作用机制可能与阻断NF-κB-p65的表达，抑制免疫抑制反应有关。本课题组之前对栀子柏皮汤对胆汁淤积方面研究较多，本实验探讨了栀子柏皮汤各及含栀子配伍组对刀豆蛋白ConA诱导免疫性肝损伤小鼠的保护作用及可能机制，更加完善了栀子柏皮汤及其拆方在保肝护胆作用的研究，为该中药复方在临床治疗的使用等方面具有积极的意义。

(致谢:本实验在安徽医科大学药学院科教大楼实验室完成。要特别感谢我的导师李俊教授对我的指导和教诲。在文章实验进展和写作过程中，还得到许多师兄师姐的支持和帮助，在此一并致以诚挚的谢意。)