2. 中国医科大学药学院药物化学教研室, 辽宁 沈阳 110122;
3. 中国医科大学代谢病分子机制与药物研究所, 辽宁 沈阳 110122
2. Dept of Medicinal Chemistry School of Pharmacy, China Medical University, Shenyang 110122, China;
3. Institute of Metabolic Disease Research and Drug Development, China Medical University, Shenyang 110122, China
中药葎草为桑科植物葎草Humulus scandens.(Lour.) Merr.的全草[1]。其味甘、苦，性寒。具有清热解毒，利尿消肿之功效。文献记载用于肺结核潮热、肠胃炎、痢疾、感冒发热、肾盂肾炎、急性肾炎、膀胱炎、泌尿系结石；外用治痈疖肿毒、湿疹、毒蛇咬伤等[2]。据报道葎草全草含黄酮、天门冬素、挥发油、鞣质及树脂；葎草叶含大波斯菊苷等；果实中含葎草酮、蛇麻酮等[3, 4]。本试验对葎草中的黄酮类化学成分进行提取分离，并对其主要成分进行了结构鉴定，同时探讨了黄酮类成分对小鼠肺水清除率(AFC)的影响。
1 葎草中主要化学成分的提取、分离与鉴定 1.1 仪器与材料 1.1.1 仪器RD-1熔点测定仪(天津天光光学仪器有限公司)；制备液相(P270高压恒流泵；UV230+紫外-可见检测器；大连依利特分析仪器有限公司)；Bruke-ARX-300型核磁共振光谱仪(德国布鲁克公司)；LCQ液-质联用仪(赛默飞世尔科技公司)。
1.1.2 材料色谱柱Shim-pack C18(5 μm,250×10 mm)；柱色谱用硅胶(100目，160～200目)和薄层色谱用硅胶G(60型)均系青岛海洋化工厂生产；D101大孔树脂为天津南开大学产品；HPLC所用溶剂均为色谱纯(山东禹王试剂有限公司生产)；实验所用其它试剂均为分析纯。
1.2 药材葎草采自沈阳北陵地区，经鉴定为桑科(Moraceae)葎草属(Humulus)植物葎草Humulus scandens(Lour.)Merr.的全草。标本保存在中国医科大学药学院中心实验室。
1.3 提取与分离 1.3.1 提取取干燥葎草全草10 kg，切碎后，第1次加10倍量70%乙醇提取2 h，第2次加8倍量70%乙醇提取1 h，第3次加6倍量70%乙醇提取1 h，合并提取液，回收乙醇至无醇味；加入氯仿萃取3次，每次1 500 mL，弃去氯仿层，水层加热除去残留氯仿。将上述水层溶液加入药用级D101树脂(1 500 g)柱中，吸附12 h，先用适量水冲洗，然后用95%乙醇洗脱，洗脱液浓缩至干，备用。
1.3.2 分离取上述提取物120 g，甲醇溶解，加硅胶(100目)适量，研匀，挥干溶剂，备用；称取柱层析用硅胶(160~200目)1 200 g，湿法装柱上样后，用氯仿-甲醇不同比例进行梯度洗脱，结合薄层色谱合并相同流份，然后用制备液相精制，在(100 ∶20～30)比例的洗脱剂中得到单体化合物Ⅰ和化合物Ⅱ,见Fig1。
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| Fig 1 A. Luteolin-7-O-β-D-glucoside; B. Cosmosiin |
淡黄色结晶粉末，mp 258～260℃。盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish反应呈阳性，提示为黄酮类化合物并有糖存在。ESI-MS给出m/z:449.36[M+H]+的准分子离子峰，推测其分子质量为448，分子式为C21H20O11。UV图谱在255 nm和350 nm有吸收峰，提示可能有黄酮类化合物带Ⅰ、带Ⅱ的吸收峰存在；带Ⅱ存在肩峰，提示可能在B环3′,4′位有2个OH存在。IR在3 328 cm-1有吸收峰，结合其峰型显示可能有分子内氢键存在，1 600 cm-1左右的吸收峰提示有C=C不饱合键存在。1HNMR谱显示苷元部分有与木犀草素相似的质子信号：δ6.91(1H,d,J=8.4 Hz),7.45(1H,d,J=8.4 Hz),7.42(1H,s)是构成AMX偶合系统的B环的质子信号；δ6.79(1H,d,J=1.8 Hz),6.44(1H,d,J=1.8 Hz)为6,8位质子信号；δ6.75(1H,s)为3位氢信号；δ12.99,δ9.99,δ9.40分别为5，4′，3′位羟基质子信号。13CNMR谱有21个碳信号，δ182.0为羰基的碳信号；δ100.0,77.2,76.5,73.2,69.6,60.7为糖的碳信号。经与文献对照[4, 5]，确定该化合物为木犀草苷(luteolin-7-O-β-D-glucoside)，结构见Fig1A。
1.4.2 化合物Ⅱ淡黄色结晶粉末，mp 227～229℃。盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish反应呈阳性，提示为黄酮类化合物并有糖存在。ESI-MS给出m/z:433.25[M+H]+的准分子离子峰，推测其分子量为432,分子式为C21H20O10。UV图谱在268 nm和335 nm有吸收峰，提示可能有黄酮类化合物带Ⅰ、带Ⅱ的吸收峰存在；带Ⅱ为单峰，提示可能在B环4′位有OH存在。IR在3 190 cm-1有吸收峰，结合其峰型显示可能有分子内氢键存在，1 600 cm-1左右的吸收峰提示有C=C不饱合键存在。1HNMR(DMSO-d6)谱中，δ12.96(1H,s)为黄酮5位羟基的质子信号；δ7.96(2H,d,J=8.4 Hz),6.94(2H,d,J=8.4 Hz)(AA′BB′系统)两组双重峰，为4′位有取代的B环上的4个质子信号；δ6.87(1H,s),6.45(1H,s)为6-H和8-H信号；δ6.83(1H,s)为3-H的信号；δ5.40~4.61为糖区质子信号。13CNMR(DMSO-d6)谱有19个碳信号，B环上有两个重叠的碳信号；δ116.1归属为B环上C-3′,5′的信号；δ128.7归属为B环上C-2′,6′的信号；δ182.1为羰基的碳信号；δ100.0,77.3,76.5,73.2,69.6,60.7为糖的碳信号。经与文献对照[5, 6]，确定该化合物为大波斯菊苷(cosmosiin),结构见Fig1B。
2 葎草中黄酮类成分对小鼠肺水清除率的影响 2.1 材料健康♂昆明小鼠由中国医科大学实验动物中心提供，动物合格证号: SCXK(辽)2008-0005。鼠龄8~10周，体质量20~30 g，按试验设计分组，每组10只。LGL和AGL均为实验室自制(高效液相归一化法测定LGL和AGL纯度均>98%)；小牛血清白蛋白(BSA,Sigma公司)，阿米洛利(Amiloride,Sigma公司)，特布他林(Terbutaline,Sigma公司)；生理盐水，G250，水合氯醛，氧气等。
2.2 试验过程各组别药物均采用等渗5%小牛血清白蛋白生理盐水溶液配制。动物分组见Tab1，小鼠腹腔麻醉(按300 mg·kg-1的剂量给予10%水合氯醛)后，钝性分离气管，插管后，经三通阀通入氧气。随后经插管处三通阀注入各组别溶液0.3 ml。通过小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)给予麻醉小鼠100% O2，通气30 min，然后用1 ml注射器经气管插管缓慢负压吸取肺泡内液体[7, 8]。溶液中白蛋白量的测定，以空白溶液作为参照，通过全自动定量酶标仪测出，按下面的公式计算AFC。
| Group | Drug |
| Blank group | - |
| Control group | 1 mol·L-1 Amiloride |
| 0.1 mol·L-1 Terbutaline | |
| Test group | 0.2 mol·L-1 LGL |
| 0.2 mol·L-1 AGL | |
| 0.2 mol·L-1 LGL+1 mol·L-1 Amiloride | |
| 0.2 mol·L-1 AGL+1 mol·L-1 Amiloride |
AFC=[(Vi-Vf)/Vi]×100，Vf=Vi×Pi/Pf 式中Vi和Vf分别代表起始注入肺泡内(i)和灌注30 min后吸出的肺泡液(f)液体体积，P是白蛋白浓度。
2.4 统计学处理数据结果以
± s表示，数据比较采用单因素方差分析。
葎草醇提液浓缩后，氯仿萃除叶绿素，采用药用级D101树脂吸附，洗脱后得到120 g的吸附物(采用高效液相归一化法测定，其中包含50.6%木犀草苷和30.2%大波斯菊苷)，约占药材1.2%。上硅胶柱分离，并精制后，得到单体化合物。利用波谱解析结构，与文献数据核对后确定其中2种成分为木犀草苷和大波斯菊苷。
3.2 葎草中黄酮类成分对小鼠肺水清除率的影响通过小鼠AFC试验，测定得出7个不同组别的AFC，结果见Tab2。
| (AFC, ± s，n=10) |
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| Group | AFC/% |
| Blank group | 29.1±4.6 |
| Amiloride group | 20.5±4.1* |
| Terbutaline group | 39.2±4.8* |
| LGL group | 33.6±3.1* |
| LGL+Amiloride group | 28.0±2.6# |
| AGL group | 32.8±3.0* |
| AGL+Amiloride group | 28.5±3.2# |
| *P＜0.05 vs blank control group;#P＜0.05 vs LGL or AGL group | |
本实验主要针对葎草中的黄酮类成分进行提取分离研究。70%乙醇提取后用氯仿淬去叶绿素，然后用大孔吸附树脂对黄酮类成分进行吸附，吸附物上硅胶柱分离，在氯仿 ∶甲醇(100 ∶20～30)比例的洗脱剂中得到4种化合物，制备液相精制后，光谱鉴定为尿嘧啶、木犀草苷、大波斯菊苷和牡荆素。其中木犀草苷和大波斯菊苷含量最高，对其药效学进行了初步研究。本方法综合了以往文献报道的方法，既采用树脂吸附，又通过硅胶柱层析分离，大大提高了单体成分的纯度，利于后面的精制过程。
4.2 肺水清除率试验阿米洛利作为上皮细胞钠通道的阻断剂给予后，明显降低正常组小鼠的肺水清除率；而特布他林作为促进钠通道的激动剂，能够增加正常组小鼠的肺水清除率。LGL和AGL试验组均能促近小鼠肺泡对水的重吸收，与空白组相比差异有显著性，而当两组中分别加入阿米洛利后又使肺水清除率降低，说明二者可能是通过促进钠通道开放的机制完成水分的重吸收，试验模式及结果推论见Fig2。
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| Fig 2 Mode patterning of test design and results *P < 0.05 vs blank control group |
以往肺水肿治疗遵循Starling定律，属被动转运机制，静力因素在肺水肿的形成和消散过程中起重要作用。心源性肺水肿常规的药物治疗包括利尿药(呋塞米静脉注射)，血管扩张药(硝酸甘油或硝普钠静脉泵入)，正性肌力药(毛花苷丙稀释后静脉注射)，升压药(多巴胺静脉泵入)和吗啡等。非心源性肺水肿病人对常规使用的治疗药物反应的效果欠佳。急性肺水肿往往需要气管插管和机械通气。
因通过上皮细胞钠通道(ENaC)能主动重吸收肺泡内的水分，动力主要来源于底膜侧的Na+，K+-ATP酶，本试验中AGL和LGL能增强ENaC主动转运功能，使钠通道由基态变成激发态，使肺泡内水液主动重吸收回到体循环，增强肺泡通气与换气功能，改变了以往肺水被动吸收的方式，为肺水肿开辟了新的治疗方式，模式图见Fig3。
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| Fig 3 Model of alveolar fluid clearance(AFC) |
(致谢：本试验在药学院中心实验室完成，对参与药物提取等工作的王星晧、牛兴、刘文姝等同学一并表示感谢！)
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