延胡索乙素(tetrahydropalmatine,THP)是中药延胡索的主要活性成分，研究证实它可缓解头痛、胸痛、关节痛以及外伤导致的疼痛^[1]，但对于延胡索乙素治疗神经病理性疼痛则鲜有报道^{[2, 3]}，涉及到的机制包括延胡索乙素激活多巴胺D1受体以及抑制脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)水平。然而，延胡索乙素是否通过调节Cav1.2水平来缓解神经病理性疼痛，目前尚未见报道。近年来研究发现电压门控钙通道(voltage-gated calcium channels,VGCC)与神经病理性疼痛密切相关，L型VGCC，尤其是Cav1.2亚基参与了神经病理性疼痛的发生发展^{[4, 5]}。另外有研究发现，在豚鼠单个心肌细胞中，延胡索乙素可有效阻滞L型钙电流^{[6, 7]}，表明延胡索乙素和L型VGCC密切相关。延胡索乙素是否通过影响L型VGCC Cav1.2亚基来缓解神经病理性疼痛是本实验研究的主要任务。

本实验主要通过观察坐骨神经慢性压迫性损伤模型(chronic constriction injury,CCI)下，延胡索乙素对小鼠背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)Cav1.2表达的影响，探讨延胡索乙素对小鼠神经病理性疼痛的影响及其可能的机制。

♂ C57BL/6小鼠，清洁级，40只，7~8周龄，体质量22~27 g，由南京大学模式动物中心提供(批号：J000664)。将小鼠随机分为5组：假手术组(S组)、坐骨神经结扎组(C组)、延胡索乙素组(L组)。按照神经病理性疼痛诱发和持续的时间，又将 L组分为诱导期组(induction)、诱导维持期组(induction with maintenance)、长程低剂量组(long-term low-dose)。S组小鼠分离坐骨神经但不结扎，C组和L组建立CCI模型。

左旋延胡索乙素(dl-THP)(A007452，上海将来实业股份有限公司)，兔抗Cav1.2抗体(ACC-003，以色列Alomone公司)，正常兔血清(AR1010，Boster公司)，免疫组化试剂盒DAB显色液(K5007，丹麦DAKO公司)，Von Frey(美国Stoelting公司)，冷热测痛仪(YIS-21A，济南益延科技发展有限公司)。

按照Bennett等^[8]所述的方法制备小鼠CCI模型。用1%戊巴比妥(10 mg·kg^-1,ip)麻醉小鼠并固定于手术台上，剪毛消毒后切开小鼠右下肢股中部皮肤，钝性分离肌肉暴露坐骨神经，在接近其分叉处用4-0丝线结扎3道，间隔约1 mm，结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动、减慢，但不阻断通过表层血管的循环为宜。生理盐水冲洗创面，逐层缝合切口，左侧作为自身对照，术毕分笼，常规饲养。

参考Choi等^[9]和徐叔云教授主编的《药理实验方法学》^[10]以及预实验结果，确定给药方法及给药剂量。诱导期组于疼痛诱导期(0~5 d)、诱导维持期组于疼痛诱导期及维持期(0~5 d、14~19 d)给予延胡索乙素(45 mg·kg^-1,ip)，每日1次；长程低剂量组从术后即刻开始至实验终止给予延胡索乙素(15 mg·kg^-1,ip)，每日1次。

各组小鼠分别于术前1 d，术后5、14、19 d测定机械痛阈和热痛阈。机械痛阈用机械刺激回缩阈(MWT)表示，热痛阈用热刺激缩足反应潜伏期(PWL)表示。

测定前，将小鼠放入一置于金属筛网上的19×15×12(cm³)塑料箱内适应15 min，测定时用Von Frey垂直刺激小鼠右足底中部皮肤，以强度渐升的顺序进行刺激，纤维丝的压力值依次为0.07、0.16、0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0 g。刺激持续时间≤4秒，每个时间点重复5次，每次间隔时间5 min，小鼠出现抬足或舔足行为为阳性反应，如超过10.0 g仍未出现机械刺激引起的阳性反应，则记为10.0 g。5次重复实验中有3次出现上述反应，则认为该点为机械刺激回缩阈 (mechanical withdrawal threshold,MWT)^[11]。

将冷热测痛仪预热在(55±0.3)℃范围，将小鼠置于热板上，以出现抬足或舔足行为为阳性反应，此时测痛仪上的值为热刺激缩足反应潜伏期(thermal paw withdrawal latency,PWL)。刺激持续时间不超过30 s，每次间隔时间15 min，重复3次，取其平均值^[12]。

小鼠于术后d 19给药2 h后，以(10 mg·kg^-1,ip)水合氯醛麻醉致死。 沿背部正中线剪开背部皮肤，剪断与脊柱相连的肋骨，取出腰段脊柱。沿椎管将脊柱剪成两半，挑出同侧L4-6脊髓节段背根神经节。每组随机选取5只小鼠背根神经节放入-80℃冰箱，用于Western blot分析，3只小鼠取背根神经节用4%多聚甲醛固定12 h，常规石蜡包埋，制成厚5 μm石蜡切片，用于免疫组织化学染色。

取背根神经节，加入RIPA裂解液和cocktail蛋白酶抑制剂的混合液(体积比500 ∶1)，超声匀浆后低温高速离心(5 ℃，12 000 r·min^-1，15 min)，取上清液，BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。取20 μg蛋白上样电泳(8%分离胶，5%浓缩胶)，电泳(浓缩胶电压60 V，分离胶电压90 V)后转印至PVDF膜(200 mA,3 h)，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入Cav1.2一抗(1 ∶200)或β-actin (1 ∶5 000),4℃冰箱孵育过夜。次日洗膜，加入二抗(1 ∶50 000),室温孵育2 h。采用ECL化学发光法显色曝光。

采用即用型Envision快速酶免疫组化二步法进行背根神经节Cav1.2检测。切片常规脱蜡至水后，置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH 9.0)的修复盒中，于微波炉内进行抗原修复，自然冷却后PBS冲洗3次，每次5 min；3%过氧化氢室温避光孵育25 min，灭活过氧化物酶活性；滴加3%BSA室温封闭30 min后，滴加适当稀释的一抗(1 ∶200)，4 ℃冰箱孵育过夜；PBS冲洗3次，滴加辣根过氧化物酶HRP标记的二抗，4 ℃冰箱孵育50 min；PBS洗3次后滴加DAB溶液，显微镜控制显色；苏木精复染，自来水冲洗，1%盐酸酒精分化数秒，氨水返蓝，自来水冲洗；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照实验中，用0.01 mol·L^-1 PBS(pH=7.4)代替一抗，结果为阴性。每只小鼠随机选取背根神经节切片3张，在400倍的视野下，每张切片随机选取2个视野进行观察，以胞质内出现棕黄色颗粒分布计为阳性细胞。由两名操作者分别用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件观察并计数细胞总数及阳性细胞个数，结果取平均值，计算阳性细胞百分率。

所有数据均用SPSS 19.0软件完成统计分析，正态分布的资料用 ± s表示，组间比较用单因素方差分析；非正态分布的数据(机械痛阈、热痛阈)以中位数(四分位数间距，interquartile range,IQR)表示，组间差异比较采用非参数检验。

造模后，C组小鼠出现跛行、舔舐伤口、避免伤侧肢体负重、悬足等行为学变化，且机械痛阈和热痛阈于术后d 5~19均明显降低。S组无上述变化，L组出现上述轻微表现。

各组小鼠术前基础机械痛阈、热痛阈差异无显著性，S组小鼠术前与术后差异无显著性。与术前比较，C组与L组小鼠机械痛阈、热痛阈均明显降低(P < 0.05)，且C组术后d 14阈值降至最低，以后逐渐恢复，至术后d 19仍明显低于术前。与C组比较：L组术后d 5，诱导期组、诱导维持期组机械痛阈明显增高(P < 0.01)，热痛阈无明显改变(P>0.05)；长程低剂量组机械痛阈、热痛阈均无明显改变(P>0.05)。与C组相比较：L组术后d 14，诱导期组、诱导维持期组以及长程低剂量组机械痛阈明显增高(P < 0.01)，诱导期组及诱导维持期组的热痛阈未见明显改变 (P>0.05)，长程低剂量组热痛阈明显增高(P < 0.01)。与C组比较：术后d 19，诱导维持期组(P < 0.01)与长程低剂量组(P < 0.01)机械痛阈、热痛阈均明显增高;诱导期组机械痛阈明显增高(P < 0.05),热痛阈没有明显改变(P>0.05)；且与诱导期组相比，长程低剂量组机械痛阈、热痛阈明显增高，差别具有显著性(P < 0.01)(Tab1)。

Tab 1 Comparison of MWT,PWL of mice at different time points after CCI [M(Q)]

表选项

在预期的240 ku、43 ku处检测出Cav1.2、β-actin相应的蛋白条带(Fig1A)。半定量分析发现，Cav1.2在S组表达最高，C组表达最低，在诱导期组(P < 0.05)、诱导维持期组(P < 0.01)给予延胡索乙素45 mg·kg^-1以及长程低剂量给予延胡索乙素15 mg·kg^-1(P < 0.01)明显上调了Cav1.2水平(Fig1B)。

Fig 1 Expression of Cav1.2 in DRG after CCI( ± s) A:Modulation of Cav1.2 by L-THP treatment in CCI-induced pain mice. a, b, c, d, e represent sham, CCI, induction period, induction with maintenance period and long-term low-dose group, respectively; B:Showing the results of three different experiments represented as the relative densities of protein bands normalized to β-actin.*P < 0.05,**P < 0.01 vs CCI.

图选项

免疫组化结果显示，背根神经节中Cav1.2阳性细胞胞质有棕黄色颗粒，少部分胞核、胞膜着色(Fig2A)。Cav1.2阳性细胞在对照组(32.78%±16.58%)表达最高，在CCI组(10.29%±6.17%)表达最低。诱导期组(20.09%±9.25%)、诱导维持期组(25.00%±6.20%)以及长程低剂量组(27.79.%±12.23%)Cav1.2阳性细胞表达率明显高于C组(P < 0.01)(Fig2B)。

Fig 2 Expression of Cav1.2 in dorsal root ganglia in different groups ( ± s) A:The expression of Cav1.2 positive cells in the dorsal root ganglia in immunohistochemical staining. a, b, c, d, e represent sham, CCI, induction period, induction with maintenance period and long-term low-dose group, respectively. Bar=50μm;B: The comparison of ratio of Cav1.2 positive cells in the dorsal root ganglia in the different groups.*P < 0.05,**P < 0.01 vs CCI.

图选项

本实验中，C组和L组小鼠均出现跛行、舔爪、足悬空等疼痛行为学表现，C组小鼠机械痛阈和热痛阈术后d 5~19均明显降低，表明小鼠神经病理性疼痛模型制备成功。本实验Western blot以及免疫组化结果发现，脊髓背根神经节Cav1.2在C组表达水平最低，S组表达水平最高，在诱导期组、诱导维持期组及长程低剂量组表达明显上调，差异具有统计学意义(P < 0.05，P < 0.01)，与行为学检测结果延胡索乙素可以明显缓解神经病理性疼痛诱发的机械痛敏和热痛敏同步，这提示了延胡索乙素可能是通过上调脊髓背根神经节神经元Cav1.2亚基来发挥镇痛作用的。本实验发现，高剂量延胡索乙素可以缓解诱导期、维持期的机械痛敏以及维持期的热痛敏，低剂量延胡索乙素对诱导期的机械痛敏和热痛敏均无明显作用，这与Choi等^[9]报道的结果相符。本研究还发现，和诱导期应用高剂量延胡索乙素相比，长程低剂量延胡索乙素可以更有效缓解神经病理性疼痛诱导的机械痛敏和热痛敏(P < 0.01)，且Cav1.2表达水平也明显高于诱导期应用高剂量延胡索乙素(P < 0.05)，提示了长程低剂量应用延胡索乙素优于诱导期应用高剂量延胡索乙素。

延胡索乙素作为镇痛镇静药与Cav1.2的相互作用机制目前尚不明确。本实验中，脊髓背根神经节Cav1.2在C组表达水平最低，这与Kim等^[13]的报道一致。Kim等认为，损伤的背根神经节神经元Cav1.2表达下调的原因可能与周围神经损伤后，背根神经节神经元细胞体的神经肽Y(NPY)增加以及背根神经节神经元交感芽生所致的去甲肾上腺素的释放有关。而有研究^{[14, 15]}发现，延胡索乙素可作为单胺耗竭剂降低中枢及外周组织去甲肾上腺素浓度。此外，延胡索在缓解创伤性应激引起的焦虑和抑郁的同时，抑制了下丘脑NPY的降低^[16]。因此，可以推断延胡索乙素与去甲肾上腺素及NPY有密切关系。延胡索乙素可能通过与NPY相互作用或者通过与NPY及去甲肾上腺素共同作用，调节Cav1.2的表达来缓解神经病理性疼痛。

本实验首次探究了延胡索乙素可以通过上调L型电压门控钙通道Cav1.2亚基的水平来发挥镇痛作用，为延胡索乙素临床治疗神经病理性疼痛提出了一个新的可能机制。同时，根据神经病理性疼痛的发生及维持情况，通过设置不同的组别来探讨延胡索乙素治疗神经病理性疼痛的可能最佳方式，为应用延胡索乙素治疗神经病理性疼痛提供了临床参考。