脑缺血/再灌注损伤是一种以氧化应激反应亢进造成可逆性脑缺血损伤加重，或使可逆性脑损伤转化为不可逆性损伤的病理过程[1]，国内外研究者对其机制进行了大量的研究并取得一定进展，但仍缺乏有针对性的治疗策略[2, 3]，即使是目前唯一获得美国FDA临床治疗脑卒中的组织型纤维蛋白激活剂(tPA)也存在治疗有效时间短，治疗窗窄的问题。
红景天苷(salidroside,Sal)是景天科植物红景天的主要有效成分，课题组前期研究发现，Sal能够抑制细胞凋亡，增加Nissl细胞的阳性数[4]。本研究旨在通过基因芯片结果，探讨Sal对大鼠大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠神经保护作用的机制。
1 材料 1.1 药品与试剂红景天苷(由北京大学提供，纯度为98%)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma，货号T8877)；SYBR Select Master Mix(Applied Biosystems，货号R11022)；RNeasy Mini Kit(Qiagen，货号74106)；逆转录试剂盒(Fermentas，货号K1622)；caspase-3抗体(Cell Signaling Technology，货号9665)；cleaved caspase-3抗体(Cell Signaling Technology，货号9661)；β-actin抗体(碧云天生物技术研究所，货号H105)。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，参照GenBank中大鼠IL-6、Vgf、Hba-a2、Hbb-b1、Hbb、CD44、Pnpla2、Slc6a5、Slc5a7、GAPDH的引物序列，IL-6引物上游序列5′-AGACTTCACAGAGGATACCACCCAC-3′；下游序列5′-CAATCAGAATTGCCATTGCACAA-3′，PCR扩增片段长度为129 bp。Vgf引物上游序列5′-GCCCTCGGTCCCTTCTCA-3′；下游序列5′-GGCCAGCCGCTCTTCTTG-3′，PCR扩增片段长度为304 bp。Hba-a2引物上游序列5′-CAGGTCAAGGCTCACGGCAA-3′；下游序列5′-AGCAGGCAGTGGCTCAGGAA-3′，PCR扩增片段长度为158 bp。Hbb-b1引物上游序列5′-GCCAGTCTGCTGATTGTCTACCC-3′；下游序列5′-AGTTCACTGAGGCTGGCAAAGG-3′，PCR扩增片段长度为188 bp。Hbb引物上游序列5′-CCTGATGATGTTGGTGGCGAG-3′；下游序列5′-GCCATCATTGAAGGCGTTTATC-3′，PCR扩增片段长度为165 bp。CD44引物上游序列5′-TGAGAATGAATGGCAGGGGAA-3′；下游序列5′-CTTGTCCCATTGGATGTGAGATT-3′，PCR扩增片段长度为176 bp。Pnpla2引物上游序列5′-GAACCAACCCAACCCTTTGCT-3′；下游序列5′-AGGGTGGTCATCAGGTCTTTCG-3′，PCR扩增片段长度为183 bp。Slc6a5引物上游序列5′-TTGTCAGCGGGAGTGAAGAGTA-3′；下游序列5′-CAGGACGACATAAGGAAGGTG-3′，PCR扩增片段长度为200 bp。Slc5a7引物上游序列5′-AGACCCGTTTCAACAGATCTATGG-3′；下游序列5′-GAATGGCAATGAGTGCGGAGA-3′，PCR扩增片段长度为176 bp。GAPDH引物上游序列5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′；下游序列5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′，PCR扩增片段长度为96 bp。
1.2 实验动物SD大鼠45只，♂，SPF级，体质量(280±20) g，由福建中医药大学实验动物中心提供，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：2007000509960，许可证号：SCXK(沪)2007-0005，适应性饲养7 d后用于实验。
1.3 仪器凝胶成像分析系统(BioRad，型号ChemiDocXRS+)；荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司，型号7900HT)；电热恒温培养箱(上海一恒，型号DHP-9052)；快速混匀器(常州国华电器，型号SK-1)；高速台式冷冻离心机(Thermo Fisher，型号PrimoR)；PCR仪(美国Bio-rad公司，型号C1000)
2 方法 2.1 分组及给药方法实验大鼠随机分成3组(n=15)：假手术组(sham)、模型对照组(MCAO)，红景天苷给药组(MCAO+Sal)，同时，在栓塞2 h后分别腹腔注射生理盐水和红景天苷(50 mg·kg-1 )[1, 4]，连续给药6 d，于末次给药4 h后，取脑，用于实验。
2.2 造模大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1体质量)，沿颈部正中切开皮肤，暴露左总动脉、颈外动脉和颈内动脉，将甲聚硅氧烷涂层的尼龙单丝从左颈总动脉插入到大脑中动脉的起始端。栓塞2 h后，将尼龙单丝拔出。假手术动物进行相同的操作，除了不栓塞中脑动脉。
2.3 大鼠神经功能评分、脑梗死体积测定的统计按照Longa神经行为缺损评分标准，0级，无缺陷；1级，不能伸展对侧前肢；2级，对侧前肢屈曲；3级，轻度向对侧转圈；4级，严重的转圈；5级，对侧瘫痪。神经功能缺损评分在3～4级为模型成功，评分过程至少由2人参与完成。
连续给药6 d后，取大鼠脑组织，在视交叉及其前后各2 mm处，做冠状切片，置于TTC中避光37 ℃孵育30 min。正常组织被染成玫瑰红色，而梗死组织呈白色。染色后对组织进行拍照，采用图像分析计算梗死体积。
2.4 大鼠脑组织caspase-3、cleaved caspase-3蛋白表达的检测提取总蛋白，采用SDS-PAGE电泳，总蛋白经SDS-PAGE分离后，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜，用封闭液封闭2 h后加入一抗(caspase-3抗体稀释比例为1 ∶ 500，cleaved caspase-3抗体稀 释比例为1 ∶ 500，β-actin抗体稀释比例为1 ∶ 5 000)，4 ℃下孵育过夜，次日TBS洗3遍每次10 min加入1 ∶ 1 000稀释HRP标记的第二抗体，室温下孵育2 h后TBS洗膜。之后加ECL显色剂经凝胶成像分析系统检测，分析目标条带的灰度值，分别计算各组与β-actin灰度值的比值，并统计各组之间的差异。
2.5 大鼠基因芯片检测大鼠基因芯片由上海康成生物技术有限公司检测。
2.6 大鼠基因水平检测根据RNeasy Mini Kit提取组织总RNA，用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，以cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测各基因的表达。PCR扩增反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，退火60 ℃15 s，40个循环。以GAPDH为内参计算2-ΔΔCt值。
2.7 统计学处理用SPSS 18.0统计软件进行分析，数据用
± s表示，除了神经损伤评分分析(非参数检验，Mann-Whitney test)，其余各组数据间比较采用ANOVA方法分析。
与sham组比较，MCAO组大鼠神经功能评分和脑梗死体积明显增大，且差异有显著性(P＜0.01)；与MCAO组比较，红景天苷给药6 d，能明显降低MCAO大鼠的神经功能评分，能明显减少脑梗死体积，且差异有显著性(P＜0.01)(Fig1)。
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| Fig 1 Effects of salidroside treatment on neurological score(A) and infarct size(B) in MCAO rats(n=6) **P < 0.01 vs MCAO；##P < 0.01 vs Sham. |
与sham组比较，MCAO组大鼠cleaved caspase-3蛋白和IL-6 mRNA的表达明显升高，且差异有显著性(P＜0.01)；与MCAO组比较，红景天苷给药6 d后，能够明显降低cleaved caspase-3蛋白和IL-6 mRNA的表达，且差异有显著性(P＜0.01)(Fig2)。
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| Fig 2 Effects of salidroside treatment on caspase-3,cleaved caspase-3 protein (A) and IL-6 mRNA (B) in MCAO rats(n=6) **P < 0.01 vs MCAO；##P < 0.01 vs Sham. |
采用基因芯片方法分析脑组织基因表达图谱，发现红景天苷能逆转MCAO所引起的基因表达的变化，更重要的是，它能促进一系列与神经保护的基因表达(Fig3)。基因芯片结果均存放在开放数据库NCBI GEO: GSE52001。
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| Fig 3 Difference in expressions of related neuroprotective genes between salidroside treatment and MCAO rats in cluster analysis Each sample is the gene expression differences in an ischemic brain gene expression level minus the average of sham. The depth of the color (red and green represent the increase and decrease) shows that the difference in gene expression level compared with sham. |
与sham组比较，MCAO组大鼠Vgf、Hba-a2、Hbb-b1 mRNA的表达明显降低，且差异有显著性(P＜0.01)，MCAO组大鼠Hbb mRNA的表达也降低，且差异有显著性(P＜0.05)；与MCAO组比较，红景天苷给药6 d后，能够明显提高Vgf mRNA的表达，且差异有显著性(P＜0.01)，同时也能提高Hba-a2、Hbb-b1、Hbb mRNA的表达，且差异有显著性(P＜0.05)(Fig4)。
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| Fig 4 Effects of salidroside treatment on Vgf(A), Hba-a2(B), Hbb-b1(C), Hbb(D) mRNA in MCAO rats(n=6) *P＜0.05，**P < 0.01 vs MCAO；#P < 0.05,##P < 0.01 vs Sham. |
与sham组比较，MCAO组大鼠CD44、Pnpla2、Slc6a5、Slc5a7 mRNA的表达明显降低且差异有显著性(P ＜ 0.01)；与MCAO组比较，红景天苷给药6 d后，能够降低CD44、Pnpla2 mRNA的表达，且差异有显著性(P＜0.05)，同时也能够降低Slc6a5、Slc5a7 mRNA的表达，且差异有显著性(P＜0.01)(Fig5)。
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| Fig 5 Effects of salidroside treatment on CD44(A), Pnpla2(B), Slc6a5(C), Slc5a7(D) mRNA in MCAO rats(n=6) *P＜0.05，**P < 0.01 vs MCAO;##P < 0.01 vs Sham. |
本研究发现红景天苷能够促进MCAO模型大鼠Vgf、Hba-a2、Hbb-b1、Hbb基因的表达水平。Vgf是一种由神经细胞和神经内分泌细胞表达的多肽，不仅广泛存在于中枢神经系统和外周神经系统中，且在嗅觉系统、大脑皮质、下丘脑、海马也有大量Vgf mRNA表达[5]，有研究表明，Vgf具有增加海马突触的可塑性、增强海马齿状回神经元的增殖和再生作用[6]。脑对缺血缺氧损伤极为敏感，Hba-a2、Hbb-b1、Hbb是血红蛋白(hemoglobin，Hb)的亚基，Hb对氧的结合、贮存、运输、释放具有重要的生理作用，其亚基与氧的结合能力有关。有文献报道，在高原上生存的生物有依靠增加Hb的量来适应低氧环境，也有通过改善Hb结构与功能来增强对氧的亲和力[7]。
Caspases是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶，凋亡的最后实施是通过caspases的激活而实现的。而caspase-3是caspases级联反应中下行的最关键的凋亡执行蛋白酶，caspase-3正常以酶原的形式存在于胞质中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成[8]。缺血后的脑损伤通常伴随着炎症反应的发生并介导继发性的脑损伤。IL-6是与早期神经功能恶化和预后不良有关的炎症因子，张艳丽等[9]发现在脑缺血/再灌注损伤的海马组织中IL-6的含量明显增加。CD44是单基因编码的一种细胞膜表面糖蛋白，属于黏附分子家族，主要表达于中性粒细胞，在器官形成和组织修复过程中对细胞与细胞、细胞与基质之间的黏附有着重要的作用[10]。CD44还作为一种激活分子使炎症介质表达并促进炎症的发生[11]。在脑缺血情况下，容易出现能量代谢障碍。ATGL(adipose triglyceride lipase)是脂肪甘油三酯脂肪酶，又称为Pnpla2，是一种催化甘油三酯第一步水解的重要脂肪酶，在机体能量代谢调节中发挥重要作用[12]。Slc6a5(solute carrier family 6,member 5)是一种神经递质转运体，与神经功能有关。Slc5a7(solute carrier family 5,member 7)是一种胆碱转运体，参与乙酰胆碱的合成和释放。乙酰胆碱是中枢和周围神经系统的神经递质，具有调节认知和运动功能[13]。本研究发现红景天苷能够降低MCAO模型大鼠cleaved caspase-3蛋白及IL-6、CD44、Pnpla2、Slc6a5、Slc5a7基因的表达水平。
综上所述，红景天苷能够降低MCAO模型大鼠神经功能评分，减少脑梗死体积，具有神经保护作用，此作用可能与促进突触可塑性相关因子Vgf及氧运输相关因子Hba-a2、Hbb-b1、Hbb的表达，抑制凋亡因子cleaved caspase-3，炎症因子IL-6、CD44，能量代谢相关基因Pnpla2及神经递质相关基因Slc6a5、Slc5a7的表达有关。
(致谢：本实验在福建省中药学重点实验室完成，感谢实验室的老师对本实验的帮助与指导。)
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