宫颈癌是一种严重影响女性身心健康的疾病，据世界卫生组织报告发病率占所有癌症的12%,仅次于乳腺癌^[1]。估计到2020年,将有1600万新增病例，年龄主要集中在15至44岁之间^[2]。报道显示有80%以上宫颈癌是由人类乳头瘤病毒 (HPV)感染引起,HPV可以激活宫颈中原癌基因或抑制抑癌基因，使宫颈肿瘤的病毒DNA整合到染色体DNA中，从而增强细胞增殖能力导致宫颈癌的发生^{[3, 4]}。

ARM重复蛋白家族是指含有多个armadillo repeat结构的蛋白，其成员在肿瘤形成、细胞间通信以及细胞骨架形成等方面发挥着重要作用^[5]。Armadillo repeat 结构包含了3个螺旋结构，分别为 H1、H2和H3^{[5, 6]}。ALEX蛋白是一个新的ARM重复蛋白家族成员，主要由ALEX1、ALEX2和ALEX3组成。 其中ALEX1 (arm proteins lost in epithelial cancers on chromosome X1) 蛋白序列含有两个 Armadillo repeat结构，其N端具有一个疏水的跨膜区。目前研究表明，在大多正常组织中均有广泛的表达，在上皮组织来源的肿瘤中低表达或者不表达^[7]。有关报道也证明ALEX1参与肿瘤的发生发展^[8],过表达ALEX1能抑制直肠癌细胞的克隆形成^[9]。但有关ALEX1在宫颈癌中的作用及其机制尚未见报道。为此我们将探讨ALEX1在宫颈癌中的表达情况，并研究其对宫颈癌细胞的相关生物学行为的影响。

HeLa细胞由重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心提供。采用含10% 胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5% CO₂ 培养箱中培养。DMEM培养基、胎牛血清购自Hyclon公司；Opti-MEM购自Gibco公司；Lipofectamine RNAiMAX 购自Invitrogen公司；siRNA由上海吉玛公司合成；BCA试剂购自碧云天公司；CCK-8试剂盒购自Promega公司；DAB底物显色试剂盒购自Beyotime公司； SP9002免疫组化染色试剂购自北京中杉金桥生物技术公司；鼠抗人ALEX1单克隆抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体购自Santa Cruz公司；宫颈癌临床组织来源于重庆医科大学第一附属医院。

收集的临床组织用4%的多聚甲醛固定24 h，体积分数为0.5乙醇90 min、体积分数为0.7乙醇90 min、体积分数为0.85乙醇90 min、体积分数为0.9乙醇90 min、无水乙醇60 min 脱水，石蜡包埋及切片。切片的免疫组化：烘片、脱蜡与水化、封闭、加一抗、加二抗、DAB显色、镜检。根据组织的染色强度和染色阳性细胞比例进行综合性量化评分。染色强度评分标准：阴性(-)，0 分；弱阳性(+)，1分；中等阳性(++)，2分；强阳性(+++)，3分。染色阳性细胞比例评分标准：未染色细胞，0 分；染色阳性细胞比例<10%，1分；染色阳性细胞比例10%～50%，2分；染色阳性细胞比例>50%，3分。总分值=染色强度分值＋染色阳性细胞比例分值。

利用Promega软件系统设计ALEX1 mRNA的3条siRNAs序列片段。序列分别为：RNAi-1，正义链：5′-CCUGGAGCGAACAAAUGAUTT-3′，反义链：5′-AUCAUUUGUUCGCUCCAGGTT-3′；RNAi-2，正义链：5′-GCCUGCUACUGUGUAUACATT-3′，反义链：5′-UGUAUACACAGUAGCAGGCTT-3′;RNAi-3，正义链：5′-GCUGGGCU AAGACUGUUAATT-3′，反义链：5′-UUAACAGUCUUAGCCCAGCTT-3′；control siRNA，正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，由上海吉玛公司合成。干粉siRNA用DEPC水溶解稀释成20 μmol·L^-1,-20℃保存。HeLa细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%CO₂培养箱中培养。转染前将细胞制成悬浮液接种于6孔板中在37℃、5%CO₂培养箱中培养，当细胞生长到50%~60%时，加入4 μL的Lipofectamine和8 μL的siRNA溶液并补齐2 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基培养48 h。实验共4组：RNAi-1组、RNAI-2组、RNA-3组以及control siRNA组。

收集转染siRNA 48 h后的HeLa细胞，并进行蛋白提取，采用BCA法测定蛋白浓度。按50 μg/孔蛋白量上样，经 8% SDS-PAGE 胶分离后，将目的蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次15 min，再用二抗室温孵育2 h，ECL化学发光检测结果。

SiRNA转染HeLa细胞48 h后，胰酶消化收集各组细胞，1 000 r·min^-1离心5 min，弃上清液，PBS重悬清洗，1 000 r · min^-1离心5 min，重复1次，再加入1 mL PBS 混匀，转移至1.5 mL EP管中。最后加入5 μL Annexin V-FITC，振荡均匀后4℃孵育15 min，再加入5 μL碘化丙啶(PI)，孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡的情况，实验重复3次。

SiRNA转染HeLa细胞48 h后，胰酶消化收集各组细胞，1 000 r·min^-1离心5 min，弃上清液，PBS重悬清洗，1 000 r·min^-1离心 5 min，弃上清液，重复1次，体积分数为0.7乙醇重悬细胞，放置冰箱4℃，12 h。离心弃去上清，PBS清洗1次，加入含0.01％NaN 3和0.1％BSA 的缓冲液500 μL复溶细胞。加入2.5 μL RNase(100 mg·L^-1)，37℃孵育15 min，加入25 μL(10 μg·mL^-1)PI染液，避光放置15 min。流式细胞仪检测分析各组细胞的DNA含量，计算细胞周期，实验重复3次。

SiRNA转染HeLa细胞48 h后，胰酶消化重悬细胞，血球计数板计数细胞，以每孔3 000个细胞接种于96孔板中，每组3个复孔，待贴壁后分别测定 0、24、48、72、96 h的细胞生长状况。每孔加入10 μL CCK-8试剂，37℃孵育2 h，酶标仪450 nm测定OD值。

SiRNA转染HeLa细胞48 h后胰酶消化重悬细胞，血球计数板计数细胞，以每孔3 000个细胞接种于96孔板中。配制浓度为1 mmol· L^-1的白藜芦醇溶液，待贴壁后加入0、5、10、15 μL的白藜芦醇溶液，使其终浓度分别为 0、50、100、150 μmol·L^-1，按Promega公司的CCK-8测定细胞生长48 h的抑制率，每组3个复孔。每孔加入10 μL CCK-8试剂，37℃孵育2 h，酶标仪450 nm测定OD值。

应用SPSS 17.0统计软件，数据以 ± s表示。两组数据间的比较采用独立样本t检验，多组数据间的比较采用单因素方差分析。

通过免疫组化对比分析显示：与癌旁组织相比，癌组织中ALEX1的表达明显增加。此外，在癌旁组织中ALEX1的表达主要定位在细胞核中，而在癌组织中ALEX1的表达主要定位在细胞质中(Fig1)。表明ALEX1在宫颈中的表达情况与宫颈是否发生癌变有关，推测ALEX1参与宫颈癌的发生和形成。

Fig 1 ALEX1 protein expression in cervical cancer tissues and adjacent non-cancerous tissues A: cervical cancer tissues; B: adjacent non-cancerous tissues

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Western blot 结果显示：与对照组相比，实验组RNAi-3中ALEX1的蛋白表达明显下降(Fig2)。说明在3组干扰序列中RNA-3的干扰效率最好，后续实验干扰采用RNA-3序列。

Fig 2 Efficiency of siRNA silencing of ALEX1 gene detected by Western blot

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流式细胞检测周期结果显示：空白组和对照组中S期细胞比例分别为16.53％和14.41％，G₂ 期细胞比例分别为7.38％和8.30％。实验组中S期细胞比例为30.00％，G₂期细胞比例为1.72％。空白组与对照组相比，差异无统计学意义；实验组与对照组和空白组相比较，S期细胞明显增多，G₂期细胞明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明沉默ALEX1的表达阻滞HeLa细胞的周期进程(Fig3)。

Fig 3 Cell cycle distribution detected by flow cytometric analysis A:Blank group; B:Control group; C:Experimental group

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流式细胞检测凋亡结果显示：空白组和对照组中凋亡率分别为2.31％和3.15％，实验组凋亡比例分别为16.41％。空白组与对照组相比，差异无统计学意义；实验组与对照组和空白组相比较，凋亡明显增多，差异有统计学意义(P < 0.05),表明沉默ALEX1的表达促进HeLa细胞的凋亡发生(Fig4)。

Fig 4 Cell apoptosis distribution detected by flow cytometric analysis A:Blank group; B:Control group; C:Experimental group

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CCK-8结果显示：与对照组和空白组相比较，实验组在72、96 h 细胞生长明显受抑制，差异有统计学意义(P < 0.05)，表明沉默ALEX1的表达抑制HeLa细胞的增殖(Fig5)。

Fig 5 Effects of ALEX1 silence on cell growth in HeLa cells analysed by CCK-8

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CCK-8结果显示：与对照组和空白组相比较，实验组在细胞生长明显受抑制，特别当浓度为 50、100 μmol·L^-1抑制最为明显，表明沉默ALEX1的表达能提高HeLa细胞对白藜芦醇的敏感性，增加白藜芦醇对HeLa细胞的致死能力(Fig6)。

Fig 6 Effects of ALEX1 silence to resveratrol on cell growth in HeLa cells analysed by CCK-8

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Armadillo repeat结构首次发现于果蝇极性基因 armadillo，该基因在果蝇胚胎形成、维持上皮组织完整性和早期细胞极性形成中起重要作用^[10]。Arm repeat 结构的特点是在真核和原核生物中都具有保守的三维结构，其结构是由大约42个氨基酸形成3个α-螺旋，再由前后2个Arm repeat 结构相互折叠，形成1个右手超螺旋结构^[11]。Arm repeat 蛋白家族是指含有多个Armadillo repeat结构的蛋白家族，其家族蛋白在肿瘤形成、发展、细胞间通讯，维持组织完整性等多方面发挥着重要作用^[12]。

ALEX1蛋白是Kurochin在用酵母双杂交技术寻找与pp110蛋白相互作用时发现的，属于Arm repeat蛋白家族新成员。ALEX1在Xq21.33-q22.2上，其基因全长为4.2 kb，含有4个外显子，编码着453个氨基酸，蛋白质分子质量为49 ku，含有两个arm repeat结构 ，包括8个潜在的蛋白激酶C和5个酪蛋白激酶Ⅱ 结合位点^{[7, 8]}。近年来研究表明，ALEX1能够抑制人直肠癌细胞的克隆形^[9] ,ALEX1 mRNA 在心脏、脑、睾丸、前列腺、卵巢、结肠等大多正常组织组织中高表达，在人肿瘤组织中没有表达或低于其正常组织的表达。在细胞系中，ALEX1 mRNA在胶质瘤细胞系和骨肉瘤细胞系中有表达，在永生上皮细胞系、肺癌细胞系和乳腺癌细胞系中不表达，而在正常的乳腺上皮细胞系中有表达^{[7, 13]}。这些研究表明 ALEX1基因有可能参与了肿瘤的发生发展。

2010年日本学者Iseki等^[9]在直肠癌中研究ALEX1基因时发现：在直肠癌和胰腺癌中环腺苷反应元件和 E-box 基因定点突变会削弱ALEX1基因启动子的活性，过表达反应元件结合蛋白和过表达β-catenin 能促进 ALEX1基因的表达。表明环腺苷反应元件和E-box是调控ALEX1基因启动子的重要元件，ALEX1基因本身是被反应元件结合蛋白和β-catenin 蛋白调节的。除此之外ALEX1也受Wnt β-catenin信号通路的调控^[8]。

为了探讨ALEX1基因在宫颈癌中的表达情况以及对宫颈癌细胞生物学作用的影响。本研究采用免疫组化检测ALEX1在宫颈癌及其癌旁组织中的表达情况，应用siRNA干扰技术研究ALEX1对宫颈癌HeLa细胞的生物学形态影响。研究结果发现，ALEX1在宫颈癌组织中的表达高于其对应癌旁组织，沉默ALEX1表达后，HeLa细胞的周期、增殖受到抑制、促进HeLa细胞凋亡的发生，同时增强了白藜芦醇对HeLa 细胞的抑制作用，说明ALEX1与宫颈癌的发生发展有着密切联系。Wnt /β-catenin信号通路异常活化是肿瘤重要发病原因之一，Wnt/ β-catenin通路可以通过调控核内β-catenin的累积，激活Wnt 相关靶基因^[14]。ALEX1基因在宫颈癌中的激活，也有可能是Wnt /β-catenin异常活化所导致的。此外，本研究还发现，沉默ALEX1后能增强白藜芦醇对HeLa细胞增殖的抑制作用，这可能是因白藜芦醇降低了细胞内的β-catenin蛋白水平，从而抑制了Wnt/ β-catenin通路的活性^[15]，导致ALEX1的表达受抑制，促进了细胞的凋亡。

本研究首次证明，ALEX1在宫颈癌组织中高表达于其癌旁组织，沉默ALEX1能够抑制宫颈癌细胞的增殖能力，这些结果为进一步研究ALEX1在肿瘤的发生发展中的作用及其机制奠定了理论基础。同时，ALEX1有望能作为一个新的宫颈癌标志物，用于临床诊断和基因药物的开发。

(致谢：本实验完成于重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心，在此感谢本实验室的老师及实验管理人员，同时也感谢我的指导老师宋方洲教授在实验过程的指导及帮助。)