佛司可林(forskolin，FSK)是从唇形科植物毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii Briq.)中提取的二萜类化合物，化学名为7β-乙酰氧基-1α,6β,9α-三羟基-8,13-环氧-labd-14-烯-11-酮。药理学研究提示FSK是腺苷酸环化酶激活剂，能升高多种组织细胞中的环腺苷酸(cAMP)浓度，从而参与细胞功能的调节，包括降血压、降低眼压、强心、平喘、抗肿瘤、抗血栓、抗炎症、抗过敏和抗抑郁等作用[1, 2, 3, 4]。
基于FSK是强效的腺苷酸环化酶激活剂，cAMP作为细胞内的重要第二信使参与激素的分泌，那么FSK对肾上腺皮质细胞激素分泌作用及其机制如何，值得关注。在体外研究中，人与小鼠肾上腺皮质细胞系或细胞株经常被采用[5]，其中，Y1细胞是最常用的小鼠肾上腺皮质瘤细胞株。本文主要报道FSK对Y1细胞皮质酮的促分泌作用及对类固醇激素合成酶与相关转录因子表达的影响。
1 材料与方法 1.1 细胞株小鼠肾上腺皮质瘤细胞(Y1 mouse adrenocortical tumor cell)，购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所(细胞资源中心)。
1.2 药品与试剂FSK和RIPA裂解液购自上海碧云天生物试剂有限公司，二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma-Aldrich公司。新生牛血清、100 U·L-1青、链霉素、DMEM-F12培养液均购自Hyclone公司。TRIzol购自Invitrogen公司；PrimeScript? RT reagent Kit、SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)II购自TaKaRa公司；采用Primer3(v.0.4.0)在线软件设计引物，并委托Life Technologies公司合成。小鼠皮质酮ELISA试剂盒购自Cayman公司。抗体anti-mice β-actin购自Sigma-Aldrich，anti-rabbit StAR和anti-mice NR4A1购自Abcam公司；免疫印迹化学发光试剂ECL试剂盒购自Pierce公司。
1.3 主要仪器7500 Fast Real-Time PCR System实时荧光定量PCR仪(ABI公司)，Elx800型酶标仪(Biotek公司)，Alpha化学发光凝胶成像系统(Protein-Simple公司)，等。
1.4 细胞培养及分组Y1细胞用含10%新生牛血清、100 U·L-1青链霉素的DMEM-F12培养液常规培养，置于5% CO2、37℃湿饱和的条件下培养。细胞生长至80%～85%融合时，用0.25%胰酶(含EDTA)消化后，铺板后培养，取其对数生长期细胞进行实验。药物干预细胞时，采用1%新生牛血清培养液，依据实验目的分别采用1 μmol·L-1或10 μmol·L-1 FSK分别处理Y1细胞15 min、30 min、1、2、4、6、12和24 h等相应时间，对照组(Con)采用0.1% DMSO做对照，并收集细胞上清培养液用于检测皮质酮含量、收集细胞进行mRNA与蛋白表达检测。
1.5 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测皮质酮含量Y1细胞经1 μmol·L-1 FSK治疗24 h后，收集细胞培养上清液，根据小鼠皮质酮ELISA试剂盒说明书进行操作，检测培养液中皮质酮含量。
1.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测基因mRNA表达上下游引物序列采用Primer3(v.0.4.0)在线软件合成(Tab1)，委托Life Technologies公司上海合成部完成。按照TRIzol试剂盒说明书抽提肾上腺总RNA；逆转录反应体系20 μL，反应条件为37℃×15 min，85℃×5 s，4℃；PCR扩增反应体系为20 μL，反应程序为95℃×3 min，95℃×30 s，60℃×30 s，40循环。基因相对表达量分析方法：采用2-ΔΔCT法分析，以正常组作为对照组，以ppia基因Ct均值作为内参组，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因(其中，Ct值为扩增n个循环基因的荧光数值)，ΔΔCt=ΔCT实验组-ΔCT对照组，目的基因相对表达量=2-ΔΔCT。
| Gene | GenBank No. | Primer sequences | Product/bp |
| Ppia | NM_008907 | Forward 5′-GTCTCCTTCGAGCTGTTTGC-3′ | 234 |
| Reverse 5′-GATGCCAGGACCTGTATGCT-3′ | |||
| Cyp11a1 | NM_019779 | Forward 5′-GCTGGAAGGTGTAGCTCAGG-3′ | 224 |
| Reverse 5′-CACTGGTGTGGAACATCTGG-3′ | |||
| Cyp11b1 | NM_001033229 | Forward 5′-GTATCGAGAGCTGGCAGAGG-3′ | 140 |
| Reverse 5′-GGGTTGATGTCGTGTCAGTG-3′ | |||
| Star | NM_011485 | Forward 5′-TTGGGCATACTCAACAACCA-3′ | 103 |
| Reverse 5′-GAAACACCTTGCCCACATCT-3′ | |||
| Mc2r | XM_006504285 | Forward 5′- GTTCGTTGGGATGAACGACT-3′ | 188 |
| Reverse 5′- ATTCGGGTGTCATGAATGGT-3′ | |||
| Nr4a1 | NM_010444 | Forward 5′-CTTGAGTTCGGCAAGCCTAC-3′ | 117 |
| Reverse 5′-GGTGTCAAACTCTCCGGTGT-3′ | |||
| Nr4a2 | NM_001139509 | Forward 5′-CGGTTTCAGAAGTGCCTAGC-3′ | 214 |
| Reverse 5′-TTGCCTGGAACCTGGAATAG-3′ | |||
| Nr5a1 | NM_139051 | Forward 5′-CATGGTCTTTAAGGAGCTGGAG-3′ | 275 |
| Reverse 5′-TGAGGAACTTGAGACAGACGAA-3′ |
采用RIPA裂解液处理Y1细胞，收集蛋白质样品并予以定量，通过变性处理，分别执行聚丙烯凝胶电泳、转膜、封闭、一抗孵育、洗涤、二抗孵育、再洗涤、显影等实验流程，其中，一抗浓度内参β-actin以1 ∶ 20 000稀释、StAR抗体1 ∶ 1 000稀释、NR4A1抗体1 ∶ 500稀释。以β-actin为内参对照，分析蛋白相对表达量。
1.8 统计学分析采用GraphPad.Prism5.0专业软件进行作图、及统计分析，采用Newman-Keuls post-hoc方差分析。
2 结果 2.1 FSK对Y1细胞生长形态的影响Y1细胞在基础培养状态下，生长较快，约3～4 d传代培养，细胞呈贴壁样扁平状生长，经1 μmol·L-1 FSK干预3、6、12和24 h后(Fig1)，可见细胞逐渐皱缩成圆球状，可能与细胞骨架弹性纤维应力变化有关。
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| Fig 1 Y1 cells morphology at different time points by 1μmol·L-1 FSK treatment |
基础状态下Y1细胞皮质酮分泌量较低，经1μmol·L-1 FSK治疗24 h后，皮质酮分泌明显升高(Fig2)。
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| Fig.2 Forskolin stimulates corticosterone production in Y1 cells **P<0.01 vs control group (Con) |
我们采用1μmol·L-1 FSK干预Y1细胞24 h，检测了皮质酮合成过程相关酶的基因表达，与对照组比较，FSK明显增加类固醇急性调节蛋白酶(Star)基因表达(Fig3A)；同样，FSK明显增加皮质酮合成第一步骤限速酶Cyp11a1基因表达(Fig3B)；也明显增加皮质酮合成最后一步关键酶Cyp11b1基因表达(Fig3C)；但是，基础培养状态下，Y1细胞促肾上腺皮质激素受体(Mc2r)转录水平很低，经FSK处理后，Mc2r基因上调趋势差异无显著性(Fig3D)。
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| Fig 3 Forskolin increases steroid hormone synthesis enzymes mRNA expression after treatment for 24h in Y1 cells A: Star mRNA expression was increased significantly by 1μmol·L-1 FSK treatment for 24h. B: Cyp11a1 mRNA expression was increased significantly by 1μmol·L-1 FSK treatment for 24h. C: Cyp11b1 mRNA expression was increased significantly by 1μmol·L-1 FSK treatment for 24h. D: There was no significant differences in Mc2r mRNA expression after 1μmol·L-1 FSK treatment for 24 h. **P<0.01 vs Con. |
此外，我们采用10 μmol·L-1 FSK不同时程干预Y1细胞15 min～12 h，并检测了调节皮质酮合成的即刻早期基因表达，结果发现，FSK治疗Y1细胞1 h即可明显增加Star基因表达，并呈现典型的时效关系(Fig4A)；FSK治疗Y1细胞15 min即明显增加孤儿核受体(Nr4a1)基因表达、且治疗1 h后Nr4a1上调最明显，达40倍，之后升高幅度逐渐减弱(Fig4B)；同样，FSK治疗Y1细胞15 min即明显增加孤儿核受体(Nr4a2)基因表达、且治疗1 h后Nr4a2上调非常明显，达120倍，4 h后Nr4a2表达逐渐趋向正常(Fig4C)；然而，FSK对孤儿核受体(Nr5a1)基因表达无明显影响(Fig4D)。
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| Fig 4 Immediate early genes mRNA expression by 10μmol·L-1forskolin treatment from 15 min to 12 h in Y1 cells A: Star mRNA expression was increased significantly by FSK. B: Nr4a1 mRNA expression was increased significantly by FSK. C: Nr4a2 mRNA expression was increased significantly by FSK. D: There was no significant difference in Nr5a1 mRNA expression after FSK treatment. *P<0.05, **P<0.01 vs control group. |
此外，我们检测了1 μmol·L-1 FSK干预Y1细胞不同时间后StAR与NR4A1蛋白表达，结果显示，对照组Y1细胞StAR蛋白表达非常弱，经FSK干预6 h后StAR蛋白表达量升高，24 h后升高更明显(Fig5A)；同样，NR4A1蛋白在对照组不能检测其表达，经FSK干预1 h后仍未见表达，6 h后可见NR4A1蛋白表达明显升高(Fig5B)。
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| Fig.5 Forskolin stimulates protein expressions after treatment for indicated time in Y1 cells A: StAR protein expression was induced significantly by FSK treatment for 6 h and 24 h. B: NR4A1 protein expression was only increased significantly by FSK treatment for 6 h. |
肾上腺皮质是机体合成与分泌盐皮质激素、糖皮质激素和少量性激素的重要组织，其生理功能还受上游的高级中枢垂体和下丘脑所调控。在体外研究中，Y1细胞是经常被使用的小鼠肾上腺皮质细胞株，然而，Y1细胞是否保留体内肾上腺皮质的全部功能尚存在争议，有实验室报道，Y1细胞对ACTH有应答作用，且主要通过cAMP和蛋白激酶A信号通路起作用[6, 7]，也有报道Y1细胞对ACTH无应答作用[8, 9]，我们前期的研究提示，Y1细胞对ACTH应答反应很弱，推测可能是Y1细胞反复保种传代失去此功能。由于类固醇激素分泌细胞与第二信使cAMP有关，因此，Y1细胞是否对腺苷酸环化酶激活剂FSK具有应答作用，本文进行了深入探讨，我们前期的研究发现不同浓度FSK对Y1细胞增殖实验差异较小，因而，本研究分别采用较低浓度1 μmol·L-1 FSK处理Y1细胞24 h、较高浓度10 μmol·L-1 FSK干预Y1细胞15 min～12 h，并进行了相关指标的检测。
由结果可知，Y1细胞对FSK应答出现较早且作用强烈，经1 μmol·L-1 FSK干预后细胞形态变化明显，推测可能与细胞骨架弹性纤维应力变化有关，从而导致细胞皱缩成圆球状，并促进激素的合成、分泌与释放，通过检测细胞培养液激素含量，发现1μmol·L-1 FSK作用24 h后，皮质酮水平明显增加约4倍。经过对皮质酮合成过程的几个关键酶的基因表达检测，发现FSK明显增加类固醇急性调节蛋白酶(Star)基因表达上调30倍，并在FSK干预1 h开始逐渐升高，皮质酮合成第一步骤限速酶Cyp11a1和最后一步关键酶Cyp11b1基因表达也分别上调4倍和10倍，结果提示FSK通过激活腺苷酸环化酶，快速增加StAR蛋白表达以促进细胞内胆固醇转运至线粒体内膜，并通过限速酶Cyp11a1促进胆固醇裂解为孕烯醇酮，最后在Cyp11b1酶作用下促进皮质酮的合成与分泌。然而，基础培养状态下，Y1细胞促肾上腺皮质激素受体(Mc2r)转录水平很低，经1 μmol·L-1 FSK处理后，Mc2r基因表达有升高趋势，但差异无显著性，有学者也发现Mc2r对FSK应答弱[10]。
值得注意的是，FSK不仅可促进皮质酮合成酶表达上调，还可促进调节皮质酮合成过程的一些转录因子表达，尤其是NR4孤儿核受体基因表达，在10 μmol·L-1 FSK干预1 h后升高幅度达40～120倍，在10 μmol·L-1 FSK作用6 h后NR4A1蛋白表达也明显升高，由于Nr4a1和Nr4a2属于即刻早期表达基因，提示FSK对皮质酮合成过程中即刻早期表达基因作用强烈且短暂，据报道NR4家族分子直接参与对人肾上腺皮质细胞(H295R)皮质激素分泌的调控[11, 12]。然而，10 μmol·L-1 FSK对NR5孤儿核受体分子无明显影响，有报道认为Nr5a1(SF-1)分子主要参与肾上腺皮质细胞的发育与分化[13]，可能与皮质激素合成的功能关系不密切。
综上所述，本研究观察佛司可林对小鼠肾上腺皮质瘤细胞皮质激素合成酶及其转录调控因子的作用、及其对细胞皮质酮分泌的影响，我们发现小鼠肾上腺皮质瘤Y1细胞对腺苷酸环化酶激活剂佛司可 林具有强烈的应答反应，以促进皮质酮合成与分泌的药理学作用为突出特征，因此，该研究为佛司可林作为Y1细胞皮质激素的合成与分泌的强有效诱导剂提供科学依据。
(致谢：本研究在上海中医药大学国家中医药管理局细胞分子生物学三级实验室完成。)
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