2. 湖北科技学院药学院药理教研室, 湖北 咸宁 437100
2. Dept of Pharmacology, Hubei University of Science and Technology, Xianning Hubei 437100, China
糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是由糖尿病引起的一种心脏结构和功能障碍，独立于高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心脏瓣膜病及其他已知心脏疾病[1]。DCM的发病机制非常复杂，目前尚未完全阐明，现有研究认为，氧化应激导致的心肌细胞凋亡是糖尿病患者非缺血性心力衰竭发生的重要原因[2]。有研究显示，糖尿病氧化应激水平升高与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶活化相关[3]。本研究拟观察不同时间高糖刺激对H9c2心肌细胞凋亡调节蛋白以及NADPH氧化酶亚单位表达的影响，探讨NADPH氧化酶在高糖诱导的心肌细胞损伤中的作用，为防治糖尿病心肌细胞病变提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 细胞系H9c2细胞购自武汉大学细胞典藏中心。
1.1.2 药品与试剂DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，单克隆Bax和Bcl-2抗体购自美国CST公司，p22phox、p47phox以及p67phox抗体购自美国Santa Cruz公司。
1.1.3 主要仪器CO2培养箱(德国Heraeus公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus)；垂直式电泳仪、电转移槽(美国Bio-Rad公司)；多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)；自动发光凝胶成像系统(英国SYNGENE公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养H9c2细胞培养于含10%胎牛血清、抗生素(50 kU·L-1青霉素+50×103 g·L-1链霉素)的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养。待细胞生长接近70%融合时，0.25%EDTA-胰酶消化、传代培养。取对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 实验分组① H9c2细胞随机分为:正常对照组(使用含葡萄糖5.5 mmol·L-1的DMEM培养基)，11、22、33、44、55 mmol·L-1高糖培养基刺激24 h组。② H9c2细胞随机分为：正常对照组(使用含葡萄糖5.5 mmol·L-1的DMEM培养基)、33 mmol·L-1葡萄糖刺激12、24、36、48、72 h组。
1.3 指标测定 1.3.1 细胞存活率检测实验结束后弃上清液，每孔加入5 g·L-1 MIT工作液30 μL，10%血清培养基270 μL，共同培养4 h，加入DMSO在490 nm波长下检测，酶标仪检测各孔的光密度(OD)值。
1.3.2 Western blot检测实验结束后弃上清，PBS清洗细胞。每组加入80 μL细胞裂解液，冰上震荡裂解30 min。用干净的细胞刮刀迅速来回刮动板底细胞，1.5 mL离心管收集细胞碎片和裂解液，于4 ℃下13 000 r·min-1离心15 min。BCA法检测蛋白浓度，每条泳道加蛋白样品50 μg，根据不同抗体的效价，加入用TBST适当稀释的一抗，置于4 ℃冰箱过夜 。加入HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠的IgG抗体，置室温孵育1 h。用TBST漂洗后，加入ECL荧光液，显影。
1.4 统计学方法 所有数据以 
± s表示，用SPSS 11.5统计学软件进行分析，行One-Way ANOVA检验。
MTT测定结果表明，正常对照组细胞存活率以100%参照，高糖可致心肌细胞存活率随着高糖浓度以及刺激时间延长而逐渐下降，心肌细胞在33 mmol·L-1高糖刺激24 h后存活率开始明显下降，与正常对照组比较差异具有统计学意义(P < 0.05)。见Fig1。
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| Fig 1 Influence of high glucose on cell viability in H9c2 cardiac cells (n=10) *P < 0.05 vs control group. |
H9c2经过高糖处理12 h后，心肌细胞调控凋亡的蛋白表达开始发生改变，表现为抑制细胞凋亡的蛋白Bcl-2表达减少，而促凋亡发生的蛋白Bax表达增加，与正常对照组比较差异具有统计学意义(P < 0.05)，提示心肌细胞凋亡的可能已经发生。见Fig2。
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| Fig 2 Influence of high glucose on the expression of Bcl-2 and Bax in H9c2 cardiac cells (n=3) *P < 0.05 vs control group. |
为进一步探讨高糖损害心肌细胞的可能机制，我们研究与氧化应激密切相关的NADPH氧化酶。H9c2细胞经过高糖刺激12 h后NADPH氧化酶亚基p22phox和p47phox表达水平持续升高，与正常对照组的差异具有统计学意义(P < 0.05)；而p67phox蛋白表达在高糖刺激24 h后持续升高，与正常对照组比较差异具有统计学意义(P < 0.05)。见Fig3。
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| Fig 3 Influence of high glucose on the expression of NADPH submits in H9c2 cardiac cells (n=3) *P < 0.05 vs control group |
糖尿病与心血管疾病的发生密切相关，糖尿病是微血管和大血管疾病发展中的重要风险因素，糖尿病患者心血管并发症引起的死亡率等同于确诊心脏病的非糖尿病患者[4]。糖尿病患者在调整了伴随着的心血管疾病的风险，比如冠心病或者高血压以后，仍然容易罹患心脏衰竭。DCM作为糖尿病心血管疾病的主要并发症之一，早期表现为心肌顺应性降低和舒张期充盈受阻为主的舒张功能障碍，晚期以收缩功能不全为主，并最终发展为充血性心力衰竭，重症患者甚至发生猝死[5]。
高血糖作为一种独立的危险因素能直接损害心肌[6]。高血糖状态下，细胞外基质大量增生、胶原降解异常，心肌间质纤维化发生。纤维化的增加直接促进成纤维细胞增殖，导致心肌肥大和重构，心脏功能受限[7]。心肌细胞具有不可再生性，随着凋亡的不断增加，细胞外基质逐步取代丢失的心肌细胞，加速心肌纤维化和重构进程，从而诱发心衰。糖尿病患者和实验动物研究提示，心肌细胞凋亡在DCM发生发展中发挥至关重要作用[8, 9]。目前认为，B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白家族调节细胞凋亡信号转导，与细胞凋亡密切相关[10]。正常情况下，抗细胞凋亡蛋白Bcl-2与促细胞凋亡蛋白Bax维持动态平衡，维持细胞正常的生理过程。当Bcl-2表达增多，Bax表达减少，细胞凋亡减少，反之凋亡增多。H9c2心肌细胞株来源于大鼠胚胎期心脏组织，保持了心肌细胞的特征，可用于高糖的体外作用研究。本文通过不同浓度葡萄糖刺激H9c2细胞发现33 mmol·L-1高糖可致H9c2存活率明显降低，且雷梅先等[11]报道33 mmol·L-1高糖可诱导H9c2心肌细胞凋亡。因此，本研究在此基础上进一步探讨高糖损伤心肌的可能机制。
研究表明，氧化应激导致的心肌细胞凋亡是糖尿病患者非缺血性心力衰竭发生的重要原因，NADPH氧化酶是糖尿病心血管组织活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的主要来源[12]。糖尿病时，糖脂代谢紊乱不仅使胞质戊糖途径产生的NADPH增多，而且导致线粒体的还原当量NADH产生过多，抑制了电子传递，从而使NADPH氧化酶以还原当量NAD(P)H为底物，将过多的电子传递到氧分子产生ROS。已证实，NADPH氧化酶激活所致ROS产生的增加(即NADPH源性ROS的增加)在糖尿病心肌病中起重要作用[13]。心肌细胞NADPH氧化酶由gp91phox、p22phox、p47phox、p67phox、p40phox和Rac1 6种亚基组成的复合体。其中gp91phox和p22phox亚基位于细胞质膜上，p47phox、p67phox、p40phox、以及Rac1亚基位于细胞质内。NADPH氧化酶亚基表达的增加或位于细胞质的亚基向细胞膜转移的增加均可导致NADPH氧化酶活性的增加[14]。王月芬等[15]研究发现，吡格列酮通过抑制NADPH氧化酶亚单位p22phox和p47phox的表达，抑制肾脏氧化应激水平，从而对糖尿病肾病产生保护作用。本实验结果显示：高糖刺激H9c2心肌细胞24 h后NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox以及p67phox表达持续增加，且Bcl-2表达减少而Bax表达增加，由此提示抑制NADPH氧化酶亚单位的表达可有效抑制高糖所致的心肌损伤。
综上所述，高糖刺激时间的延长可使H9c2细胞存活率明显下降，Bcl-2蛋白表达减少，而促凋亡蛋白Bax表达增加，同时使NADPH氧化酶亚基的表达增加。这提示了抑制NADPH氧化酶活性和细胞凋亡在糖尿病心血管病并发症的预防和治疗具有重要的指导意义。
(致谢:本实验在湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室完成，感谢实验室的老师对本实验的帮助与指导。)
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