2. 江西中医药大学研究生学院；
3. 江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室；
4. 江西中医药大学基础医学院方剂教研室，江西 南昌 330004
2. Yunnan Branch, Institute of Medicinal Plant, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Jinghong Yunnan 666100, China;
3. Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China;
4. College of Pharmaceutical Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China
黄芪多糖 (astragalus polysaccharides，APS) 是黄芪的主要活性成分之一，可有效治疗实验性结肠炎[1]，但其能否调节结肠炎大鼠小肠派尔集合淋巴结(peyer’s patch，PP结)中T淋巴细胞亚群水平尚不明确，本实验通过复制实验性结肠炎，观察小肠PP结中T淋巴细胞、CD25+T淋巴细胞与Th17细胞的表达，以明确APS的可能作用机制。
1 材料 1.1 动物及分组健康SD大鼠60只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，♂，体质量(210±10) g，将大鼠随机分为正常组、模型组、APS(低、中、高剂量)组、美沙拉嗪对照组6组，每组10只，适应性饲养3 d后使用。
1.2 药物及试剂APS购自于陕西森弗生物技术有限公司、美沙拉嗪购自佳木斯鹿灵制药有限公司，2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)来自于Sigma公司。FITC Anti-Rat CD4 mAb、APC Anti-Rat CD3 mAb、PE Anti-Rat CD8a mAb、APC Anti-Rat CD4 mAb、PE Anti-Rat CD25 mAb、FITC Anti-Mouse/Rat Foxp3 mAb和FITC Anti-Rat IL-17 mAb购于ebioscience公司。DMSO、佛波酯、离子霉素、多聚甲醛等均购自美国Sigma公司，RPMI 1640培养液和Hank′s液等均购自美国Gibco公司。
1.3 仪器低温高速离心机(德国 Eppendorf)；流式细胞仪(美国 BD FACSC Canto II)；CO2恒温培养箱(力新仪器)。
2 方法 2.1 造模[2]造模前禁食12 h，除正常组外，大鼠麻醉后，按100 mg·kg-1 TNBS计算，将TNBS溶入0.3mL 50%乙醇配制TNBS乙醇复合溶液，将TNBS乙醇复合液注入距肛门约8 cm处，倒置大鼠15 min，放回原笼自然苏醒，正常组注入等容积的50%乙醇。
2.2 给药方法自造模后d 1起，按体重换算，APS低、中、高剂量组分别为200、400、800 mg·kg-1 APS，美沙拉嗪对照组给予150 mg·kg-1美沙拉嗪灌胃给药，每日1次，共7 d。
2.3 流式细胞术测T淋巴细胞水平剖腹剪取小肠PP结，置于5% 胎牛血清RPMI 1640培养液中，300目不绣钢网碾磨滤过洗涤，离心后弃其上清。取100μL细胞溶液，分别加入CD4 mAb、CD3 mAb、CD8a mAb各0.3 μL，室温下孵育30 min后，离心后弃上清，1%多聚甲醛的PBS固定上机检测。
2.4 流式细胞术测CD4+CD25+Foxp3+ T细胞的表达取上述细胞悬液，用1μL CD4 mAb、1μL CD25 mAb孵育30min，洗涤后，透膜固化液孵育1 h，加1 μL Foxp3 mAb孵育1h后，1%多聚甲醛PBS溶液固定后上机待测。
2.5 流式细胞术测Th17细胞水平PP结淋巴细胞悬液用50 μg·L-1 PMA和1 g·L-1离子霉素刺激，恒温培养箱中培养2 h，加蛋白转运抑制酶布雷菲德菌素A继续培养4 h后，用1 μL CD4、1 μL CD25 mAb孵育30 min，再经洗涤后，透膜固化液孵育1 h，加1 μL IL-17 mAb孵育30 min后，上流式细胞仪检测。
2.6 统计学方法采用SSPS 13.0软件进行统计学分析，检测结果均以 
± s表示，组间比较采用t检验。
APS高、中剂量组组CD4+T淋巴细胞水平与模型组比较均明显下降 (P < 0.05或P < 0.01)；CD8+T淋巴细胞水平和CD4/CD8比值，则除低剂量组外，其他各组较模型组明显降低 (P < 0.05或P < 0.01)。
3.2 流式细胞术测CD4+CD25+Foxp3+T淋巴细胞及Th17细胞水平Th17淋巴细胞水平仅见中剂量组较模型组明显降低 (P < 0.05)；而CD4+CD25+Foxp3+T淋巴细胞水平和CD25/Th17比值，则可见APS高、中剂量组比模型组明显升高 (P < 0.05或P < 0.01)。
4 讨论PP结是肠黏膜免疫系统的重要组成部分，在结肠炎症发生后，PP结中CD4+和CD8+T淋巴细胞平衡被打破，肠道黏膜免疫平衡遭到破坏，肠黏膜屏障破坏，炎细胞浸润，粘膜损伤发生 [3]。CD25+T淋巴细胞和Th17 细胞都是CD4+T细胞亚群，其二者功能恰恰相反，Treg细胞维持免疫耐受和抑制炎症反应，而Th17细胞则多产生致炎因子而促进炎症发生，二者失衡是炎症性肠病的重要发病机制之一，因此调节二者之间的平衡是治疗IBD的主要策略之一[4]。本实验中模型组小肠PP结中CD4/CD8升高、CD25/Th17降低，说明结肠炎大鼠肠黏膜免疫失衡。APS高、中剂量组均可降低CD4+T淋巴细胞数量、调高CD8+T淋巴细胞水平，同时明显降低CD4/CD8比值，升高CD25+T细胞水平和CD25/Th17比值，且APS中剂量还可降低Th17细胞水平，说明APS在一定剂量下可能降低CD4T及Th17细胞淋巴细胞，调高CD8+、CD25+T淋巴细胞，降低CD4/CD8及升高CD25/Th17来调节T淋巴细胞亚群的平衡，从而降低异常免疫反应的程度，减轻炎症损伤，从而有效治疗实验性结肠炎。
| [1] | Yang M, Lin H B, Gong S, et al. Effect of Astragalus polysaccharides on expression of TNF-α, IL-1β and NFATc4 in a rat model of experimentalcolitis [J]. Cytokine, 2014, 70 (2):81-6. |
| [2] | 于海食,陈 浩,洪 缨,等.肠安康新组方抗溃疡性结肠炎大鼠的机制研究[J]. 中国药理学通报 ,2012, 28 (2):282-5. Yu H S, Chen H, Hong Y, et al. Mechanisms of new Chang-an-kang on ulcerative colitis in rat[J].Chin Pharmacol Bull, 2012, 28 (2): 282-5. |
| [3] | Yu X Y, Zou C L, Zhou Z L, et al. Phasic study of intestinal homeostasis disruption in experimental intestinal obstruction [J]. World J Gastroenterol, 2014, 20 (25): 8130-8. |
| [4] | Sakaguchi S, Ono M, Setoguchi R, et al. Foxp3+CD25+CD4+ natural regulatory T cells in dominant self-tolerance and autoimmune disease[J]. Immunol Rev, 2006, 212 (6):8-27. |