表1(Table 1)
2. 常德市职业技术学院医学系, 湖南 常德 415000
2. Dept of Medicine, Changde Vocational Technical College, Changde Hunan 415000, China
血浆LDL-C水平增高是冠心病 (coronary heart disease,CHD) 最重要的危险因素，降低LDL-C水平是防治心血管疾病的首选策略[1]。血浆中绝大部分LDL-C主要经LDLR途径代谢，LDLR数量、结构及功能异常等引起的高胆固醇血症增加了ASCVD患病风险[2]。LDLR的表达同时受到转录水平及翻译后水平两方面的共同调节，转录水平主要受固醇调节元件结合蛋白2 (sterol regulatory element binding protein 2,SREBP2)的调节，诱导低密度脂蛋白受体降解蛋白(inducible degrader of low-densitylipoprotein receptor,IDOL)及前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9型 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)则对LDLR进行翻译后水平的调节。IDOL具有E3泛素连接酶的作用，通过介导LDLR泛素化经溶酶体途径降解[3]，影响细胞表面LDLR的分布。他汀类药物作为3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶的竞争性抑制剂[4]，可通过升高LDLR表达，降低血浆LDL-C水平，但同时却升高了具有降低LDLR功能的PCSK9的表达，导致他汀类降脂作用受限[5]。为此，寻求具有降低IDOL及PCSK9表达，升高细胞表面LDLR水平的联合用降脂新药，仍是当前ASCVD防治的研究焦点。
姜黄素 (curcumin) 属二酮类化合物，是从姜科、天南星科植物的根茎中提取的植物多酚[6]。研究表明姜黄素可明显升高HepG2细胞LDLR的mRNA及蛋白水平，通过激活SREBP2并使得其靶基因LDLR表达水平增高[7]，起到降脂的作用。然而，Tai等[8]则认为是通过肝细胞核因子1α (hepatocyte nuclear factor 1α，HNF-1α) 抑制转录水平PCSK9的表达，降低LDLR从溶酶体途径降解，进而使HepG2细胞表面LDLR水平升高。因此，为进一步研究姜黄素的降脂机制，本实验以HepG2为对象，探讨姜黄素对LDLR的转录及翻译后水平调节，为姜黄素作为降脂药物的临床开发提供科学依据。
1 材料HepG2细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库；DMEM培养基和无支原体胎牛血清 (FBS) 购于美国Gibco公司；姜黄素和25羟胆固醇 (25HC) 购自美国Sigma公司；人源性LDL购自广州弈源公司；人源性LPDS购自美国Biomedical Technologies Inc.公司；油红O和DMSO购自美国Amresco公司；组织总胆固醇/游离胆固醇酶法测定试剂盒 (E1015/E1016) 购自北京普利莱基因技术公司；总RNA提取试剂盒 (TRIzo1 Reagent) 购自康为世纪生物科技有限公司；DiILDL购自Invitrogen公司；兔抗人的LDLR、IDOL和PCSK9抗体购自Abcam公司，山羊抗人的SREBP2抗体购自R&D公司，辣根过氧化物酶 (horseradishperioxidase,HRP) 标记的二抗：山羊抗兔和兔抗山羊均购自上海优维宁生物科技公司。其余均为进口或国产分析纯试剂。
2 方法 2.1 实验分组油红O染色及胆固醇含量酶法测定分组：① Basal，② Control (25 mg·L-1 LDL)，③ curcumin (25 mg·L-1 LDL+25 μmol·L-1 curcumin)，④ Vehicle (25 mg·L-1 LDL+体积分数为0.000 625的DMSO)。
DiI-LDL、RT-Q-PCR及Western blot实验分组：① Basal,② Control (25 mg·L-1 LDL)，③ LPDS (体积分数为0.1的LPDS)，④ 25-HC (10 mg·L-1 25-HC)，⑤ curcumin (25 mg·L-1 LDL+25 μmol·L-1 curcumin)。
HepG2细胞接种于用含有体积分数为0.1的 FBS和体积分数为0.01的青-链霉素的高糖DMEM培养液，在37℃条件下培养24 h后，再按上述分组药物孵育24 h。
2.2 油红O染色观察胞内脂质蓄积细胞培养至对数生长期，每孔105个细胞接种至预先放置好无 菌盖玻片的6孔板内，培养24 h，药物孵育24 h后，质量浓度为40 g·L-1的多聚甲醛固定30 min，油红O染色7 min，苏木精染色4 s，甘油封片，倒置显微镜拍照观察，HepG2细胞中脂滴呈橘红色，核呈蓝色。
2.3 酶法检测细胞内胆固醇细胞培养至对数生长期，每孔105个细胞接种细胞至6孔板培养24 h，再药物孵育24 h，PBS洗3次，吸干余液，加入200 μL裂解液，冰上裂解10 min，收集裂解液,6 000 r·min-1离心5 min，取上清液，按照总胆固醇含量酶法测定试剂盒 (E1015/E1016) 的说明书操作，37 ℃条件下水浴20 min后，酶标仪分别测定总胆固醇和游离胆固醇的含量。 BCA测各组细胞内总蛋白含量用于标化各样本的胆固醇值，标化后胆固醇的浓度单位为：总胆固醇 (游离胆固醇)/蛋白=μmol·g-1。
2.4 DiI-LDL摄取检测对数期生长HepG2细胞以每孔105个细胞接种6孔板内，贴壁生长24 h后，药物孵育24 h。除Basal组外，其余各组更换培养液为体积分数为0.02的LPDS+DMEM，加DiI-LDL 10 mg·L-1，避光37℃孵育4 h，含质量浓度为4 g·L-1的 BSA的PBS摇床摇洗2×5 min，PBS洗3次，质量浓度为40 g·L-1的多聚甲醛的PBS固定10 min，PBS洗3次，Hoechst 33342染色20 min，PBS洗3次，加抗荧光淬灭液，荧光显微镜观察，细胞膜呈橙红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。
2.5 RT-Q-PCR测mRNA水平对数期生长HepG2细胞以每孔106个细胞接种至50 mL培养瓶，培养24 h，药物孵育24 h后，根据TRIzo1 Reagent说明书提取总RNA,紫外分光光度仪测定OD260/OD280比值介于1.9-2.1。琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性，28s rRNA、18S rRNA条带清晰可见，RNA未被降解，提取的总RNA可用于后续实验。根据逆转录试剂盒说明书操作，取2 μg总RNA逆转录合成cDNA，反应条件为：42 ℃、30 min，85 ℃、10 min；再取2 μg逆转录产物进行real time-PCR，反应体系为20 μL，引物由上海诺伦生物医药技术有限公司设计与合成 (Tab1)。PCR反应条件：50 ℃、2 min，95 ℃、3 min，然后95 ℃、12 s，62 ℃、40 s，40个循环。用ΔΔCT来计算基因的表达水平，计算公式如下：ΔCT=目的基因CT值-β-actin基因CT值；ΔΔCT=实验组ΔCT-对照组ΔCT；实验组/对照组基因表达水平的倍数=2-ΔΔCT。
| Gene | Primer | Sequence | Size/bp |
| β-actin | F | 5′-CCCTGGCACCCAGCAC-3′ | 70 |
| R | 5′-GCCGATCCACACGGAGTAC-3′ | ||
| LDLR | F | 5′-GACTGGTCAGATGAACCCATCAAAG-3′ | 79 |
| R | 5′-AGGTCATTGCAGACGTGGGAAC-3′ | ||
| SREBP-2 | F | 5′-CAGCAGCCTTTGATATACCAGAATG′ | 86 |
| R | 5′-AGGATGTCACCAGGCTTTGGAC-3′ |
细胞接种培养24 h，药物孵育24 h后，冰上裂解30 min，收集细胞裂解液4 ℃条件下，13 000 r·min-1离心 15 min。小心吸取上清，每组预留5 μL裂解液用于BCA蛋白定量。裂解上清：SDS-loading buffer=4 ∶ 1混匀，100 ℃条件下煮沸5 min，于-20 ℃保存。电泳条件先恒压80 V，30 min，后转换为120 V，50 min；电泳完毕后切胶，0.22 μm PVDF膜甲醛活化5 min，恒流300 mA，3 h湿转转膜；质量浓度为50 g·L-1的脱脂牛奶封闭2 h；TBST稀释一抗 (SREBP2稀释1 ∶ 500；β-actin、LDLR、PCSK9 和IDOL稀释比例均为1 ∶ 1 000)，4 ℃摇床过夜，TBST洗脱一抗3×5 min；孵育二抗 (1 ∶ 5 000)，室温温和摇晃45 min，TBST洗脱二抗4×10 min；Tanon ECL高敏成像系统对结果进行检测。各组细胞目的蛋白与内参β-actin的光密度比值，分别代表各目的蛋白表达水平。
2.7 统计学分析数据均采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数值以
± s表示，两组间的比较用单因素方差分析。
为研究姜黄素处理24 h后对HepG2细胞荷脂情况的影响，油红O染色结果显示: Control组中细胞内脂滴较Basal组增多；与Control相比，Vehicle组细胞内红染脂滴无明显变化，经curcumin处理的细胞内红染脂滴明显增加，表明curcumin促进HepG2细胞脂滴蓄积增多 (Fig1)。
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| Fig 1 Curcumin accelerates LDL uptake stained by Oil-red O(×40) A:Basal; B:Control; C:Vehicle; D:Curcumin |
为研究姜黄素处理后细胞内胆固醇含量的变化，通过胆固醇酶法测定结果显示:与Basal组相比，Control细胞内TC、FC水平增高，提示细胞荷脂成功；与Control相比，Vehicle组细胞内TC、FC水平有增高的趋势，但差异无统计学意义，提示溶媒对细胞摄取胆固醇无明显影响；curcumin组细胞内TC、FC水平明显增高 (P＜0.01)，提示curcumin促使HepG2细胞摄取胆固醇使得胞内TC、FC含量明显增高 (Fig2)。
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| Fig 2 Effect of curcumin on total cholesterol and free cholesterol in HepG2 1:Basal; 2:Control; 3:Vehicle; 4:Curcumin. **P<0.01 vs Control. |
为研究HepG2细胞是否通过促进LDL摄取使胆固醇含量增高，DiI-LDL摄取实验结果显示:与Control组比较，LPDS组HepG2细胞橙红色荧光明显增高，而25-HC组红色荧光则明显降低；curcumin组HepG2细胞橙红色荧光高于Control组，表明curcumin促进HepG2细胞LDL摄取 (Fig3)。
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| Fig 3 DiI-LDL uptake by HepG2 cells treated with curcumin for 24 hours(×20) HepG2 cells were treated with 25 μmol·L-1 curcumin for 24 hours, then incubated with DiI-LDL for 4 hours. DiI-LDL uptake was detected by fluorescence microscopy.1:Basal; 2:Control; 3:LPDS; 4:25-HC; 5:Curcumin. A:DiI-LDL; B:Hoechst33342; C:Merge. |
与Control相比，LPDS组和curcumin组LDLR和SREBP2的mRNA及蛋白表达水平明显升高 (P＜0.05)；25-HC组LDLR和SREBP2的mRNA及蛋白的表达减少 (P＜0.05)；curcumin组的LDLR和SREBP2的mRNA水平明显升高 (P＜0.05)。结果提示，curcumin可能通过激活SREBP2促进LDLR表达增高 (Fig4)。
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| Fig 4 Expression of LDLR and SREBP2 mRNA and protein|treated with curcumin in HepG2 cells SREBP2 precursor (p) and mature form (m). 1:Basal; 2:Control; 3:LPDS; 4:25-HC; 5:Curcumin. *P<0.05 vs control. |
Western blot结果显示，与Control组相比，LPDS组中PCSK9蛋白明显升高 (P＜0.05)，而诱导低密度脂蛋白受体降解蛋白 (inducible degrader of low-densitylipoprotein receptor,IDOL) 蛋白表达无差异；25-HC组中PCSK9蛋白水平明显降低 (P＜0.05)，IDOL蛋白表达水平升高 (P＜0.05)；curcumin组中PCSK9和IDOL蛋白水平明显降低 (P＜0.05)。结果提示: curcumin可能通过降低了PCSK9及IDOL蛋白表达，减少了LDLR的降解，促进血浆LDL-C的清除 (Fig5)。
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| Fig 5 Levels of PCSK9 and IDOL protein expression in HepG2 cells treated with curcumin for 24 hours PCSK9 precursor (p) and mature form (m). 1: Basal; 2: Control; 3: LPDS; 4: 25-HC; 5: Curcumin. *P<0.05 vs control. |
美国心脏协会指出降低心血管事件主要归因于LDL-C的下降，他汀类药物通过竞争性抑制胆固醇合成限速酶的活性成为临床降LDL-C的首选药物，中等强度剂量他汀可降低血浆LDL-C 30%-40%的水平，不仅降低心血管事件，而且还降低了总死亡率，奠定了他汀在防控ASCVD事件中的核心地位[9, 10]。然而他汀类还通过激活SREBP2使具有诱导LDLR经溶酶体降解的PCSK9表达增高[11]，加倍他汀用药剂量仅进一步降低LDL-C的6%，且不良反应增加，致使他汀大剂量单用降脂作用受限。尽管AMG145 (PCSK9单克隆抗体) 已顺利通过临床Ⅲ期实验阶段[12]，具有明显降低血浆LDL-C水平，减少ASCVD风险的疗效，然而因其免疫原性及 临床使用方式有限均使AMG145作为生物制剂降脂药物开发存在一定的局限性。
本实验采用curcumin作用于体外培养HepG2细胞24 h，油红O染色及胆固醇酶法测定结果表明，curcumin使HepG2细胞胆固醇蓄积增多；并通过DiI-LDL摄取实验进一步表明curcumin促进HepG2细胞胆固醇摄取；LPDS是通过激活SREBP2促进LDLR mRNA及蛋白表达增高，作为阳性对照组；而25-HC是通过阻断SREBP2的激活，使LDLR mRNA及蛋白表达降低，作为阳性对照组，curcumin处理组SREBP2及LDLR mRNA及蛋白表达增高，因LDLR是SREBP2下游靶基因，结果提示curcumin可能通过激活SREBP2转录水平调节LDLR的表达增高，这一结果与Dou等[13]报道的一致。
LDLR途径担负着绝大部分血浆LDL-C的清除，LDLR的功能或表达异常产生高胆固醇血症，增加了ASCVD患病风险[14]。LDLR除了受SREBP2转录水平调节之外，还受PCSK9及IDOL翻译后水平的调节，影响着血浆LDL-C的代谢。通过GWAS (genome-wide association studies,GWAS) 结果表明,墨西哥人群中IDOL的rs9370867因N342S与高胆固醇血脂高度正相关，而荷兰人群中IDOL的R266X突变体引起明显降低血脂的效应[15]，提示IDOL多态性或突变影响人类血浆LDL-C的清除。本实验结果显示，curcumin作用后，PCSK9及IDOL蛋白表达降低，表明curcumin可能通过翻译后水平抑制LDLR经溶酶体途径降解。curcumin还可通过抑制HNF-1α的活性降低PCSK9蛋白表达，减少LDLR溶酶体降解，促进HepG2细胞胆固醇摄取[11]。但还需进一步实验证明，curcumin是否通过过多靶点抑制HNF-1α的转录活性，阻滞IDOL泛素化溶酶体降解LDLR，使LDLR蛋白表达增高，这将是本文后续研究阐述的重要目标。
(致谢：本文实验主要在生物技术系的分子生物实验室、蛋白化学实验室、细胞培养室、技能实验室及生物信息室等实验室完成，谢谢本校省部级重点心血管病研究所、肿瘤研究所、病原微生物研究所对本实验无偿提供流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等必要设备服务。)
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