2. 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室, 贵州 贵阳 550002;
3. 贵州省人民医院干医科, 贵州 贵阳 550002
2. Key Laboratory of Chemistry for Natural Products, Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550002, China;
3. General Ward, Guizhou Provincial People's Hospital, Guiyang 550002, China
在脓毒症、急性肺损伤、缺血/再灌注损伤、多器官功能衰竭等临床急危重症与病理损伤中往往伴随有纤溶凝血功能的改变和失调以及广泛的微血栓形成。而这些病理变化与内皮细胞(endothelial cells，EC)功能受损密切关联。近年来研究表明，补体在上述临床急危重症与病理损伤中扮演了重要的角色[1, 2]。补体旁路活化会造成微血管内皮细胞的活化，表达黏附分子和炎症介质，从而可能导致炎症和组织损伤[3, 4]。本文研究了补体旁路激活对微血管内皮细胞纤溶凝血功能相关分子表达的变化及PDTC、白藜芦醇的干预作用。
1 材料与方法 1.1 材料人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cells，HMEC)由本实验室传代培养；RPMI 1640培养基购自Gibco；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)为天津灏洋生物制品科技有限公司产品；人P-selectin检测ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；人VWF(von Willebrand factor)、t-PA(tissue plasminogen activator)、PAI-1(plasminogen activator inhibitor)、TF(tissue factor)检测ELISA试剂盒购自美国Assaypro公司；人TM(thrombomodulin)试剂盒购自上海鑫乐生物科技有限公司；NO(nitric oxide)试剂盒购自碧云天生物技术公司；吡咯烷二硫氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)、白藜芦醇(resveratrol，Res)购自美国Sigma公司；正常人血清(normal human serum，NHS)由本实验室多名健康志愿者献血制备而成，分装后冻存于-80℃，经补体活性检测正常，备用；灭活人血清(inactivated normal human serum，INHS)由NHS于56℃孵育30 min而得；眼镜蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)的制备和激活补体活性测定同文献[5]；其余试剂均为符合实验要求的分析纯。
1.2 仪器Forma 3111型CO2培养箱(美国Thermo公司)；Nikon TS100倒置相差显微镜(日本Nikon公司)；Milli Q超纯水系统和Elix纯水系统(美国Millipore公司)；Molecular Devices Spectra MAX-190酶标仪(美国MD公司)；5810R冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；Revco超低温冰箱(美国Thermo公司)。
1.3 方法 1.3.1 内皮细胞培养人微血管内皮细胞株HMEC由本实验室传代培养，用含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基在37℃、5% CO2饱和湿度培养箱内培养，收集对数生长期细胞进行实验。
1.3.2 血清活化参照前期已发表文献[3]的方法，将NHS与CVF(6.5×104U·L-1)等体积混合，在37℃水浴孵育30 min制成CAC(CVF-actived complement)备用。实验以INHS与CVF的孵育混合物作为对照。
1.3.3 CAC对HMEC纤溶凝血相关蛋白分子表达的影响将HMEC以1×104 cells·well-1，接种于96孔细胞培养板，培养24 h后弃上清，加入140 μL无血清RPMI 1640培养基，再加入60 μL CAC至200 μL，分别孵育不同时间，取5、15、30、60 min上清测定P-selectin、VWF，取1、6、12、24 h上清测定t-PA、PAI-1、TF、TM，上述各指标的测定均按照试剂盒说明书进行。实验同时设置灭活血清对照组及血清本底对照组(negative control，NC)。
1.3.4 CAC对HMEC表达NO的影响将HMEC以1×105 cells·well-1，接种于24孔细胞培养板，培养24 h后弃上清，后续操作同“1.3.3 ”，分别孵育12、24、48 h，取上清按试剂盒说明书步骤测定NO。
1.3.5 PDTC、Res对CAC刺激HMEC表达P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF、TM变化的影响将HMEC以1×104 cells·well-1，接种于96孔细胞培养板，培养24 h后弃上清，分别加入含不同浓度PDTC、Res的无血清RPMI 1640培养基140 μL预处理细胞1 h，再加入60 μL CAC，37℃孵育不同时间取上清检测P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF、TM。
1.3.6 PDTC、Res对CAC刺激HMEC表达NO的影响将HMEC以1×105 cells·well-1，接种于24孔细胞培养板，培养24 h后弃上清，后续操作同1.3.5 ，37℃孵育48 h，取上清测定NO。
1.3.7 统计学分析实验数据以
± s 表示，采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析。
补体旁路活化产物CAC刺激HMEC后能使P-selectin、VWF的表达瞬时上调。P-selectin的表达变化与之前研究结果[3]类似，在5 min即有明显上调，15 min时达到峰值(数据未列出)。而VWF的表达高峰在15 min，但在5 min时基本没变化(Fig1)。
|
| Fig.1Expression of VWF after HMEC exposure to CAC(n=4) *P<0.05 vs control group |
CAC刺激HMEC后，t-PA、PAI-1的表达均持续上调(数据未列)，与之前研究结果[6]类似。其中，24 h时间点刺激组t-PA为(1.941±0.468)μg·L-1，对照组t-PA为(1.185±0.179)μg·L-1，两者的差异具有统计学意义(P＜0.05)。刺激组t-PA/PAI-1比值在1 h时间点有一个明显的上调(P=0.06)(Fig2)。
|
| Fig.2Expression of t-PA and PAI-1 after HMEC exposure to CAC(n=4) |
CAC刺激HMEC后，TF的表达持续上调，TM的表达在6 h时间点后下调(Fig3)。而刺激组NO的表达下调(数据未列)，与之前研究结果[3]类似。其中，48 h刺激组NO浓度为(2.297±0.650)μmol·L-1，对照组NO浓度为(4.966±1.823)μmol·L-1，两者的差异具有统计学意义(P＜0.05)。
|
| Fig.3Expression of TF and TM after HMEC exposure to CAC(n=4) *P<0.05 vs control group |
PDTC和Res对CAC刺激HMEC表达P-selectin、VWF均具有干预作用(Fig4)。其中，高浓度的PDTC和3个浓度的Res对P-selectin的表达具有明显抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)，而低剂量的PDTC对VWF表达具有明显抑制作用(P＜0.05)。
|
| Fig.4Effect of PDTC and Res on expressions of P-selectin and VWF after HMEC exposure to CAC(n=4) *P＜0.05, **P＜0.01 vs model group |
PDTC和Res对补体活化产物CAC刺激HMEC表达t-PA、PAI-1均具有干预作用(Fig5)。其中，Res对t-PA表达的上调具有明显的抑制作用(P＜0.01)，中、高剂量的PDTC对PAI-1上调表达具有明显的抑制作用(P＜0.05)，Res能明显抑制t-PA/PAI-1比值的上调(P＜0.01)(Fig5)。
|
| Fig.5Effect of PDTC and Res on expressions of t-PA and PAI-1 after HMEC exposure to CAC(n=4) *P＜0.05, **P＜0.01 vs model group |
PDTC和Res对CAC刺激HMEC上调表达TF具有抑制作用。低剂量的Res能明显促进TM的下调表达(P＜0.05)。高剂量的PDTC及3个浓度的Res对NO的下调表达有明显干预作用(P＜0.01)(Fig6)。
|
| Fig.6Effect of PDTC and Res on expressions of TF,TM and NO after HMEC exposure to CAC(n=4) *P＜0.05, **P＜0.01 vs model group |
本研究采用CVF激活补体旁路途径来刺激微血管内皮细胞。CVF是从眼镜蛇毒中分离纯化出来的一种高度特异的补体旁路激活蛋白，与补体C3b有高度的同源性，其在血清中能与B因子特异结合，经过D因子识别和酶切，进而形成的C3/C5转化酶CVF·Bb可持续激活补体旁路，产生C3a、C3b、C5a以及攻膜复合物等多种活化产物。
研究结果显示，内皮细胞受到CAC刺激后，P-selectin、VWF表达瞬时上调，且均在15 min时达到峰值，但P-selectin的表达在5 min时明显上调，而此时VWF的表达基本未变化。P-selectin、VWF分别作为内皮细胞活化及内皮细胞受损的标志，均位于内皮细胞的Weibel-Palade内，以上结果提示两者的释放调控机制存在差异。纤溶功能相关指标t-PA、PAI-1明显上调，t-PA/PAI-1比值在1 h明显升高，提示纤溶功能的改变，而我们之前的研究也表明补体旁路的激活会导致内皮细胞纤溶功能分子的变化[6]。生理条件下，t-PA与PAI-1按1 ∶1形成稳定的复合物，当受到炎症分子等的刺激时，纤溶局部功能失调，引起血栓形成。因此，上述实验结果提示了CAC刺激HMEC可能会导致纤溶功能的失调。组织因子TF是凝血因子VII/VIIa的受体和辅助因子，具有激活凝血因子、促进血小板聚集等功能。在本研究中，TF的表达持续上调，提示了细胞表面凝血功能的变化。TM是细胞表面蛋白C抗凝血系统的重要组成成份，可作为血管内皮损伤的分子标记物[7, 8, 9]。有研究表明低密度脂蛋白、同型半胱氨酸处理内皮细胞后TM的表达会上调[10, 11]。而本实验中TM的表达下调，这提示了内皮细胞表面抗凝血功能的下降。同时，内皮细胞分泌NO明显减少。NO是体内重要的信号及功能分子，与炎症、凝血密切相关，其表达的变化是内皮细胞功能失调的重要标志[12]。以上结果表明，补体旁路激活会导致内皮细胞纤溶凝血相关分子表达的变化，从而可能导致微血管内皮细胞纤溶凝血功能的失调。
PDTC和Res的干预实验表明，其对P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF上调表达具有抑制作用，对NO下调表达具有干预作用。值得注意的是，Res对TM的下调表达具有促进作用。PDTC是NF-κB的特异抑制剂，能够通过阻止Iκb的磷酸化降解，阻碍NF-κB的p65、p50亚基向细胞核内转移等多种途径抑制NF-κB的活化，进而抑制炎症分子的表达。而Res对NF-κB及NADPH氧化酶的活化具有抑制作用[13]，从而能够明显对抗氧化应激造成的损伤。本研究中，PDTC、Res对微血管内皮细胞纤溶凝血相关分子的表达变化具有一定的影响，总体上评价，Res的作用优于PDTC。上述研究结果为深入开展相关的调控机制及干预研究提供了线索和参考。
本研究表明，补体旁路激活会导致微血管内皮细胞纤溶凝血相关分子的表达变化及潜在的功能失调，而PDTC、白藜芦醇对此种变化具有一定的干预作用，这有助于进一步认识炎症情况下纤溶凝血功能改变的发生机制，并能为临床治疗新策略及新药的筛选和研发提供参考依据和适宜的细胞模型。
(致谢:本文实验是在贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室药理与活性筛选中心孙黔云研究员实验室完成。)
| [1] | Karpman D,Tati R. Complement activation in thrombotic microangiopathy[J]. Hamostaseologie,2013, 33(2):96-104. |
| [2] | Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris J D. Complement:A key system for immune surveillance and homeostasis[J]. Nat Immunol, 2010, 11(9): 785-97. |
| [3] | 孙黔云, 李 敏, 叶巧玲, 李红玲. 补体旁路激活导致内皮细胞的活化和损伤[J]. 中国药理学通报,2012, 28(7): 925-9. Sun Q Y, Li M, Ye Q L, Li H L. Endothelial cell activation and injury induced by complement alternative pathway[J]. Chin Pharma Bull,2012, 28(7): 925-9. |
| [4] | 李红玲, 孙黔云,李 敏, 石京山. 补体旁路激活产物刺激内皮细胞NF-κB、p38MAPK、JAK2通路活化及抑制剂的干预研究[J].中国细胞生物学学报,2013, 35(6): 836-41. Li H L, Sun Q Y, Li M, Shi J S. Activation of NF-κB, p38MAPK, and JAK2 in endothelial cells induced by activated complement alternative pathway and intervention by inhibitors[J]. Chin J Cell Biol,2013, 35(6): 836-41. |
| [5] | 孙黔云, 叶巧玲, 闫银萍. 小鼠血清补体替代途径溶血活性测定的新方法[J]. 中国药理学通报,2011, 27(11): 1619-22. Sun Q Y, Ye Q L, Yan Y P. A new method for measurement of the alternative pathway activity of mouse serum complement[J]. Chin Pharmacol Bull, 2011,27(11): 1619-22. |
| [6] | 蒿雨露, 孙黔云, 李 敏. 补体旁路激活对内皮细胞纤溶功能的影响[J]. 中国药理学通报,2012, 28(12): 1272-3. Hao Y L, Sun Q Y, Li M. Effect of complement alternative pathway activation on the fibrinolytic activity of endothelium cells [J]. Chin Pharmacol Bull, 2012, 28(12): 1272-3. |
| [7] | Aso Y,Inukai T,Takemura Y.Mechanisms of elevation of serum and urinary concentrations of soluble thrombomodulin in diabetic patients:possible application as a marker for vascular endothelial injury[J]. Metabolism,1998, 47(3):362-5. |
| [8] | Boffa M C,Karmochkine M. Thrombomodulin:an overview and potential implications in vascular disorders[J]. Lupus,1998, 7 (Suppl 2):S120-5. |
| [9] | Wenzel J,Assmann J C,Schwaninger M. Thrombomodulin-a new target for treating stroke at the crossroad of coagulation and inflammation[J]. Curr Med Chem,2014, 21(18):2025-34. |
| [10] | 胥学伟, 李小鹰, 郑延松, 詹晓蓉. 低密度及氧化低密度脂蛋白对内皮细胞表达血栓调节蛋白的影响[J]. 中国微循环,2004,8(3):143-5. Xu X W, Li X Y, Zheng Y S, Zhan X R. Effect of low density lipoprotein and oxidized low density lipoprotein on the synthesis of thrombomodulin in cultured endothelial cells [J]. Chin Microcircul Jun, 2004, 8(3):143-5. |
| [11] | 郑延松, 郑秋甫, 胥学伟, 詹小荣. 同型半胱氨酸对血管内皮细胞表达血栓调节蛋白的影响[J]. 军医进修学院学报, 2004,25(4):272-4. Zheng Y S, Zheng Q P, Xu X W, Zhan X R. Effects of homocysteine on the expression of thrombomodulin in human endothelial ECV 304 cells [J]. Acad J PLA Postgrad Med Sch, 2004,25(4):272-4. |
| [12] | Gkaliagkousi E, Ferro A. Nitric oxide signalling in the regulation of cardiovascular and platelet function[J]. Front Biosci (Landmark Ed),2011, 16:1873-97. |
| [13] | Ma T,Tan M,Yu J,Tan L. Resveratrol as a therapeutic agent for alzheimer's disease[J].Biomed Res Int,2014, 2014:350516. |