治疗脑内疾病的必要途径需将药物靶向性输送入脑内。以脑靶向性的蛋白或多肽作为载体，可能会实现药物的脑靶向转运。我们实验室以往的研究表明，狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein，RVG)的衍生肽RDP(RVG-derived peptide)^[1]，可携带核酸^[2]、蛋白^[3]等生物大分子入脑。

脂质体是一种安全有效的药物递送方式。脂溶性化合物可被包裹在脂质体内核中，在体内安全释出以发挥作用。此外，脂质体较易修饰，从而可使其具有靶向性和高效性。本研究将在脂质体表面的PEG 链端连接RDP多肽，以具有抗肿瘤效果的天然植物提取物姜黄素为模型药物，研究该RDP修饰脂质体的脑靶向作用，从而可能为向脑内送脂溶性化合物以治疗脑部疾病，提供一种崭新的途径和方法。

姜黄素，纯度>98%，购自美国Sigma公司；大豆卵磷脂、胆固醇，纯度>95%，均购自上海 Aladdin公司；DSPE-PEG-NHS(PEG MW 2 000)，购自美国Nanocs公司；Cys-RDP，纯度>95%，购自上海吉尔公司；乙酸乙酯、乙腈、冰醋酸均为色谱纯。

高效液相色谱仪(包含SPD-M20A检测器和LC-20AD泵)，购自日本岛津公司；激光粒度及 zeta 电位分析仪(Nano ZS),购自英国马尔文公司；生物质谱仪autoflex speed MALDI-TOF/TOF，购自德国Bruker Daltonic公司；AB135-S 电子分析天平，购自瑞士梅特勒-托利多公司；BF-2000 氮气吹干仪，购自上海八方世纪科技有限公司；XHF-D高速分散器，购自宁波新芝生物科技有限公司。

人脑星形胶质母细胞瘤细胞U-87 MG(实验室冻存)，采用含10%胎牛血清的DMEM-H培养基培养，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度下的培养箱内。隔天换液，待细胞密度长至80%～90%时，按照1 ∶ 3的比例传代。传代时，加入消化液一定时间后去除，用培养基吹打成单个细胞悬液，取生长良好、活性大于98%的细胞进行后续实验。

昆明小鼠80只，♀♂各半，体质量(20±2)g，购自于重庆滕鑫生物技术有限公司。小鼠饲养于西南大学药学院SPF小鼠饲养室，恒温、恒湿，自由进食、进水。

按照摩尔比2 ∶ 1的比例精密称取DSPE-PEG-NHS和RDP溶于DMF中，然后加入20 μL的N-甲基吗啉，置于4 mL离心管中，在搅拌器中避光搅拌48 h。取出反应液，置于透析袋(MW 3 500)中，放入2 L去离子水中透析48 h后(每6 h换水1次)，冷冻干燥，-20℃保存。

采用薄膜分散法分别制备姜黄素脂质体(CUR-L)和RDP修饰的姜黄素隐形脂质体(RDP-CUR-L)。按照处方量(Tab1)精密称取各种脂材于10 mL茄形瓶中,加入氯仿3 mL 溶解,37℃减压旋转蒸发 10 min，使其成均匀的薄膜。然后加入1 mL去离子水，37℃于水浴摇床中水化1 h，形成悬浮液，间歇超声90 s，得到澄清透明呈淡黄色乳光的脂质体溶液，并分别过100 nm的膜使粒径分布均匀，4℃冰箱内保存。

按上述脂质体制备方法制备一系列含不同比例 DSPE-PEG-RDP的含药靶向脂质体 (DSPE-PEG-RDP分别为总摩尔量的 0.5%、1.0%、2.0%和5.0%)。采用 MTT 法考察不同密度下的 RDP-CUR-L对U87 MG细胞抑制率的影响。取对数生长期状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化液消化后，调整细胞浓度为5×10⁷·L^-1，以每孔500 μL (5 000个/孔)接种于96孔板，培养24 h贴壁后加入不同浓度的CUR-L和RDP-CUR-L，浓度依次为150、75、37.5、18.8、9.4、4.7 μmol·L^-1，孵育48 h后，弃去培养基，每孔加入浓度为5 g·L^-1的MTT(20 μL),37℃培养4 h,弃去培养液，每孔加入100 μL二甲基亚砜(DMSO)溶解蓝紫色甲臜颗粒，用酶标仪在波长为490 nm下测定光吸收值(OD)。每组实验重复3次,每个样品做3个平行样。全部实验均设DMSO对照组。计算药物抑制率和对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)。

用激光粒度及 zeta 电位分析仪分别测定CUR-L和RDP-CUR-L的粒径、Zeta电位、分散度(PDI)。

采用透析破乳法，取用均质机处理过的CUR-L和RDP-CUR-L，每组实验分成两份(每份400 μL)：一份用透析液透析6 h后，收集脂质体部分，以10%的Triton X-100破乳，经HPLC测定包裹在脂质体内的药物浓度C；另一份直接破乳，经HPLC测定姜黄素得到C₀，按照公式计算出包封率(包封率=C/C₀×100%)。

取制得的CUR-L和RDP-CUR-L，分成两个实验组，每组平行3次，分别于3、7、15、30、45、60 d后肉眼观察脂质体溶液变化，HPLC测包封率。

采用动态透析法(dynamic dialysis)^[4] ,按中国药典2010版附录XC第三法(小杯法)测定释放度。精密量取制剂CUR-L、RDP-CUR-L各0.5 mL，经释放介质稀释至3 mL,装于透析袋内(截留分子质量为8 000 u)，两端扎牢，放入150 mL释放介质中，释放介质为含有0.2％十二烷基硫酸钠的人工胃液，37 ℃ 下姜黄素在此释放介质中的溶解度为80 mg·L^-1，满足漏槽条件。37 ℃ 恒温水浴搅拌 (转速为 100 r·min^-1)。分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24 h各个时间点取样 0.3 mL，并及时补充等温的相同体积空白介质。微孔滤膜过滤，按照HPLC方法检测姜黄素含量，并计算累积释药百分率 (%)。

C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm，大连依利特分析仪器公司);流动相：乙腈 ∶ 4%冰醋酸(48 ∶ 52)，流速：1 mL·min^-1，检测波长：430 nm，柱温：25℃。

将姜黄素溶解于1%羧甲基纤维素钠中，配制成浓度为1 g·L^-1的CUR混悬液，制得的CUR-L和RDP-CUR-L浓度均为1 g·L^-1，CUR、CUR-L、RDP-CUR-L均按照姜黄素30 mg·kg^-1的剂量于小鼠尾静脉注射给药。

取昆明小鼠，禁食12 h，尾静脉分别注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L，于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12 h各个时间点分别取小鼠心、肝、 脾、肺、肾、脑(每个时间点3只)，用生理盐水清洗后用滤纸吸干，剪碎，精密称重，加入1mL生理盐水，用组织匀浆器匀浆，加入1 mL乙酸乙酯，涡旋3 min，3 000 r·min^-1离心10 min，精密吸取上清液，再加入相同体积的乙酸乙酯，萃取2次，合并上清液，氮气吹干，加入10倍体积的流动相，超声、涡旋使其充分溶解，过膜后进样。

专属性：取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑各空白组织匀浆液 0.3 mL,样品处理后采用HPLC法分别进样测定空白样品、空白样品加内标及小鼠尾静脉注射给药后的样品。

标准曲线：取小鼠空白组织匀浆液,精密加入姜黄素标准溶液,配制成 1.6、3.1、6.2、12.5、25、50 mg·L^-1 系列浓度的样品溶液,样品处理后，以姜黄素的峰面积与样品中姜黄素的浓度(C)进行线性回归。

回收率与精密度：配制低、中、高浓度 (3、12.5、50 mg·L^-1) 的姜黄素质控样品,各5份,按“样品处理”项下方法处理,进样测定。以姜黄素的峰面积代入标准曲线方程,计算出姜黄素的浓度,与实际加入量比较,计算方法回收率,用以表示准确度; 以相应低、中、高浓度的姜黄素对照品溶液直接进样,以质控样品中姜黄素峰面积与对照品溶液中姜黄素峰面积比较,计算提取回收率; 1 d内进样测定5次,连续测定 5 d,计算日内 RSD 和日间 RSD。

生物质谱分析反应产物DSPE-PEG-RDP的结果如Fig1 所示。RDP相对分子质量为3 671，DSPE-PEG-NHS分子质量为3 094，得到的产物 DSPE-PEG-RDP 相对分子质量约为6 800，说明导向化合物制备成功。

Fig.1 MALDI-TOF-MS spectrometry of DSPE-PEG-RDP with a peak at the m/z range around 6 800

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CUR-L和RDP-CUR-L粒径、zeta 电位、分散度和包封率如Tab2 所示。结果表明，CUR-L粒径为(81.20±5.13)nm,而RDP-CUR-L经RDP修饰过后粒径为(98.56±6.97)nm，分散性良好,包封率均大于85%,制备重现性较好。

CUR-L和RDP-CUR-L 4℃冰箱放置60 d后，溶液依旧澄清透明，呈淡黄色乳光，与新制备时相比无明显变化。不同时间点测其包封率，可以看出RDP修饰对姜黄素脂质体包封率影响不大，60 d后CUR-L和RDP-CUR-L的包封率仍然在80%左右，可见稳定性良好。见Fig2。

Fig.2 Entrapment efficiency of RDP-CUR-L at different time points(x±s ,n=3)

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结果如Fig3所示，当加入的DSPE-PEG-RDP为总摩尔量的1.0%时，RDP-CUR-L对U87细胞的抑制作用明显优于CUR-L(P < 0.01)。随着DSPE-PEG-RDP比例的增加，U87 细胞的存活率逐渐降低，这表明在脂质体的 PEG 链端连接 RDP能增强对U87细胞的抑制作用，当加入比例达5.0%时，RDP-CUR-L对U87细胞的抑制作用最强，与0.5%时相比差异有显著性(P < 0.05)。当比例超过1%时，RDP-CUR-L对U87细胞的抑制变化不明显，表明继续增加 DSPE-PEG-RDP的量并不能提高RDP-CUR-L对U87细胞的抑制率。密度筛选实验结果表明，DSPE-PEG-RDP的加入比例能影响脂质体的靶向效率。出于实验效果和经济性考虑，选取加入比例为 1.0%进行以下的实验。

Fig.3 Cell inhibition rate of CUR-L and different density of peptide RDP modified liposomes against U87 cells(n=3) **P < 0.01 vs CUR-L group;#P < 0.05 vs 0.5% group

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由于姜黄素在水中几乎不溶解,采用加入 2% 十二烷基硫酸钠 (SDS) 的人工胃液为释放介质，考察姜黄素制剂的释药情况。结果如Fig4所示,CUR-L在前6 h内大量释放,累计释放量接近60%，而后进入慢速释放期，12 h释放量约为80%，而RDP-CUR-L释放在该释放介质中较慢，6 h后释放约45%，24 h后累积释放量不到80%，表明RDP-CUR-L有着更好的缓释作用。

Fig.4 In vitro release profiles in 2% SDS artificial gastric juice for CUR-L and DP-CUR-L (n=3)

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在上述色谱条件下,方法专属性良好,峰形良好,保留时间约为14 min,组织中的内源性物质不干扰样品测定,见Fig5。样品中的姜黄素在1.562 5～50 mg·L^-1线性关系良好(r=0.999 4)。方法回收率为(95.87±4.98)%,高、中、低3个浓度的提取回收率分别为 (94.79±1.94) %、(95.26±2.87) % 和 (95.18±1.78) % (n=5),日内精密度和日间精密度小于 15%,均符合生物样品分析方法的要求。

Fig.5 HPLC chromatogram of three tissue samples A: Blank brain sample；B: Blank brain+curcumin(2 mg·L-1); C: Brain sample + RDP-CUR-L.

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小鼠尾静脉注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L后不同时间各组织中的姜黄素分布见Fig6。注射CUR后，随着时间的推移，姜黄素在各个脏器中含量逐渐减少，姜黄素大量分布在肺、肝、肾等脏器中，心、脾中也有少量分布，然而由于血脑屏障的作用，脑部并未检测到姜黄素。注射CUR-L后，由于易被网状内皮系统吞噬，姜黄素主要分布在肝、肾、肺中，在脑、脾中少量分布，而在心脏中没有检测到姜黄素。RDP-CUR-L经尾静脉给药后大致分布与CUR-L类似，但在脑中检测到大量的姜黄素，并且在小鼠体内的滞留时间明显延长，24 h仍然能在脑中检测到姜黄素(Fig7)。

Fig.6 Tissue concentration of curcumin in mice after iv injection of CUR, CUR-L or RDP-CUR-L at different time points (n=3)

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Fig.7 Curcumin distribution in brain of mice after iv injected with CUR-L and RDP-CUR-L at different time points(n=3)

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脂质体作为药物载体具有使药物被动靶向网状内皮系统、延长药物作用时间、减少药物不良反应、提高疗效等优点^[5]。表面经柔性高分子PEG修饰，增大了脂质体的空间位阻，同时提高了膜表面亲水性，使得其不易被网状内皮系统(reticular epithelial system，RES)摄取，因而PEG化的脂质体较普通脂质体更长效。

虽然脂质体经 PEG 修饰后能够延长在体内的循环时间，增加在肿瘤组织中的聚集，但是由于“PEG dilemma”现象的存在^[6]，阻碍了肿瘤细胞对 脂质体的内吞，故在脂质体的 PEG 链端连接靶向配 体如叶酸、转铁蛋白、抗-EGFR 抗体等^{[7, 8, 9, 10]}，使得靶向配体与肿瘤细胞过度表达的受体特异性结合，通过“配体-受体”特异性识别与结合作用，能够促进细胞对载体的內吞，增加药物的抗肿瘤效果，并且可以定向地将药物运送到靶部位，实现对肿瘤组织的“主动靶向”。

脂质体或者纳米粒子表面修饰特异性配体或受体，主动靶向特定肿瘤组织的文献已有大量报道。一些常见的细胞穿膜肽，如TAT、多聚Arg、转运素，已被证实能够在体外将核酸、蛋白等小分子物质转 导入培养的细胞^[11]。Khafagy 等^[12]研究发现，L-型 穿膜肽penetratin可以明显增加胰岛素的渗透性，从而使其穿过鼻膜,并不会对鼻吸收黏膜上的细胞完整性造成明显的破坏。据文献报道，另一个从狂犬病毒糖蛋白衍生出的一个小肽与多聚Arg连接后，能够输送 siRNA 靶向性地进入中枢神经系统，导致相关基因沉默^[13]。KaiPharmaceutical 公司应用 Tat 引导蛋白激酶C抑制剂的蛋白调节子，用于脑缺血和急性心肌缺血的治疗，并且已于2007年进入了Ⅱ期临床试验。

然而，用细胞穿膜肽引导脂质体等纳米载体进入特定的组织，特别是脑组织的文献却并不多见。普通CPPs虽然能介导各类分子入胞，但是其缺乏细胞特异性，而本实验中所用的细胞穿膜肽RDP是一种来源于狂犬病毒糖蛋白RVG，并经过结构改造而得到的一种能靶向中枢神经系统、具有很强嗜神经性的衍生肽，同时具有良好的穿膜特性和对神经细胞的高度选择性。实验室前期研究已表明RDP能够引导核酸、多肽等小分子物质入脑，而本实验中通过体内分布实验证明了RDP连接的姜黄素脂质体在体内运输过程中没有发生断裂，确实能够携带包裹了姜黄素的脂质体入脑，不仅仅拥有理论意义，也具有潜在的应用价值。这为脑部疾病的治疗提供了新的思路。

(致谢:本实验是在西南大学药学院智能生物药物课题组全体老师和同学的帮助和支持下完成的。)