糖尿病血管病变是糖尿病主要的慢性并发症之一。高血糖能通过诱导内皮细胞功能障碍，加速细胞凋亡而导致血管内皮受损，从而引起动脉粥样硬化(As)的发生[1]。瓜蒌皮(亦称栝楼皮)是葫芦科植物栝楼或者双边栝楼等的果皮，具有清热化痰，利气宽胸的功效，主要用于治痰热咳嗽、咽痛、胸闷、消渴等疾病[2]。前期研究表明，瓜蒌皮提取物能通过清除自由基，减少一氧化氮(NO)的灭活，对糖尿病大鼠血管内皮有保护作用[3]，但并未对其保护机制做详细的阐述。高血糖时的活性氧等因素损害血管内皮，导致其抗氧化能力降低[4]，而高糖诱导的氧化应激能通过激活核因子NF-κB 途径，促使内皮细胞凋亡，释放各种细胞因子，引发一系列的病理改变，最终导致疾病发生[5]。因此本研究在前期实验的基础上进一步分离瓜蒌皮有效成分，采用高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡模型，探讨瓜蒌皮对内皮细胞的保护机制是否涉及NF-κB 途径。
1 材料 1.1 药材及细胞株实验用瓜蒌皮购自湖南省郴州市老百姓大药房(经湖南省郴州市药品检验所黄丽彬副主任中药师鉴定为葫芦科植物栝楼干燥成熟果皮)；人脐静脉血管内皮细胞株HUVECs(编号：C-003-5C)，购自中国科学院细胞生物学研究所上海细胞库。
1.2 主要试剂胰蛋白酶，武汉亚法生物技术公司； DMEM 培养基，Hyclone 公司；胎牛血清(FBS)，浙江杭州四季青公司；MTT，Sigma公司；细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒，碧云天生物技术研究所，批号：C0003；NF-κB激活-核转运检测试剂盒，碧云天生物技术研究所，批号：SN368；caspase-3 活性检测试剂盒，碧云天生物技术研究所，批号：C1115；NF-κB p65 抗体，Abcam公司，批号：ab16502；其余试剂均为市售分析纯产品。
1.3 仪器MCO-15AC 二氧化碳培养箱(日本三洋公司)，CXK41 荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS)，JHT- DDC 超净工作台(山东省济南洁康设备厂)，荧光酶标仪(Thermo公司)，Mini-Protean Tetra System ( 美国Bio-Rad 公司) ，TGL-16G-A 台式低温离心机(上海安亭科学仪器厂)，LS-B50L-Ⅰ立式压力蒸汽灭菌器(江阴滨江医疗设备有限公司)，FA1604 电子分析天平(上海精密仪器公司)。
2 方法 2.1 药物的制备将100 g瓜蒌皮粉碎，用70 %的乙醇冷凝回流，将回流所得溶液浓缩后用氯仿萃取，再将萃取液浓缩至浸膏。采用硅胶柱层析法分离所得浸膏，选用极性较大的甲醇：氯仿系统作为洗脱剂。收集中间层即得瓜蒌皮有效成分(extractvie pericarpium trichosanthes,EPT)，再将其浓缩回流，所得浸膏静置在空气流通处挥干，得到样品5.89 g。用DMSO配制成储备液(50 g·L-1)，DMSO终浓度控制在0.1 %。
2.2 细胞培养HUVECs 接种于含10 % 胎牛血清的低糖DMEM 培养基的细胞培养瓶中，置于37℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养，2~3 d换液1次，待细胞铺满培养瓶的80% 时，用2.5 g·L-1 的胰蛋白酶消化，用培养基终止消化，均匀接种于6 孔或96 孔的培养板中。
2.3 实验分组实验分为4 组：①正常对照组(Control)：实验中不加任何物质干扰；②高糖损伤组(Glucose)：在细胞培养系中加终浓度为30 mmol·L-1 的葡萄糖；③EPT 预处理组(+EPT)：在细胞培养系中预先用终浓度为12.5、25、50 mg·L-1 EPT 预处理1 h，再加30 mmol·L-1 葡萄糖和终浓度为12.5、25、50 mg·L-1 EPT继续共培养；④高渗组(Mannitol)：在细胞培养系中加终浓度为30 mmol·L-1甘露醇。各组细胞培养48 h后检测相应指标。
2.4 MTT 法检测HUVECs 细胞的存活率收集对数生长期的HUVECs,以1×105·L-1 的密度接种于96 孔板。贴壁24 h后，同步化12~24 h，分别按上述实验分组培养48 h，加入20 μL 5 g·L-1 MTT，使其终浓度为0.5 g·L-1，置于培养箱继续培养4 h。小心吸取各孔培养液，每孔加入150 μL DMSO，微震荡15 min，选择490 nm 为测定波长，用酶标仪测量各孔的OD 值，以无细胞孔为空白对照，每组6 个复孔，重复3 次。以对照组为100%。
2.5 Hoechst 33258 荧光染色观察细胞核的形态学改变将细胞按实验分组处理后，去除各孔上清液加入固定液，固定15 min后用PBS洗两遍，再加入Hoechst 33258 染色液，染色5 min后用PBS洗两遍，滴一滴抗荧光淬灭封片液，激发波长350 nm，发射波长460 nm，于荧光显微镜下观察蓝色细胞核，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白，用软件Image J 计算细胞凋亡率。
2.6 比色法测定细胞内caspase-3的活性分别收集各组细胞，PBS洗两次，600×g 4℃离心5min 收集细胞，PBS洗1次，按每2×106个细胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min，4℃ 20 000×g离心15 min。把上清转移到冰浴预冷的离心管中，Bradford法测定蛋白浓度。各组取相同量蛋白，分别加入10 μL Ac-DEVD-pNA(2 mmol·L-1)后混匀，37℃孵育120 min，用酶标仪于405 nm 波长处测定其吸光度值，结果以各组与正常对照组比值表示。
2.7 Western blot法检测NF-κB p65 蛋白的表达提取贴壁细胞总蛋白并通过考马斯亮蓝法测定其蛋白含量。所提细胞总蛋白经SDS-PAGE 分离后以β-actin 为内参照，兔抗羊NF-κB p65-IgG 为一抗，通过Western blot法测定其NF-κB p65 相对表达量，实验重复3 次。
2.8 NF-κB 核移位检测吸除培养液，PBS 洗1 次，加固定液固定15 min 后，洗涤液洗涤3 次，每次3 min，加免疫染色封闭液，室温封闭1 h 后去除封闭液，加入NF-κB p65 抗体，4℃ 孵育过夜，而后洗涤3 次，再加入抗兔Cy3，室温孵育1 h后洗涤，加入细胞核染色液(DAPI)，室温染色5 min，吸除染色液洗涤，滴加适量的抗荧光淬灭封片液，荧光显微镜下观察NF-κB 染色为红色荧光,细胞核染色为蓝色荧光。
2.9 统计学方法数据用SPSS17.0 统计软件进行处理，数据用
± s表示。组间差异显著性采用单因素方差分析(One-Way ANOVA) 进行统计学分析，组间的两两比较采用LSD法。
高糖处理明显抑制HUVECs细胞活力(P＜0.01)。不同浓度EPT处理48 h后，HUVECs的存活率较高糖组明显升高，呈剂量依赖性(P＜0.05 或P＜0.01)，由此推测，EPT可明显拮抗高糖诱导的HUVECs损伤(Fig1)。
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Fig 1
Effect of EPT on high glucose-induced cellular viability in human umbilical vein endothelial cells ( ± s,n=6)
1：Control; 2:Glucose 30 mmol·L-1; 3:+EPT 12.5 mg·L-1; 4:+EPT 25 mg·L-1; 5:+EPT 50 mg·L-1; 6:Mannitol 30 mmol·L-1, *P＜0.05, **P＜0.01 vs Glucose group.
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高糖孵育48 h后，HUVECs凋亡细胞明显增加(P＜0.01)。不同浓度EPT处理48 h后，凋亡细胞较高糖组明显减少，呈剂量依赖性(P＜0.05 或P＜0.01)。甘露醇组凋亡细胞与正常对照组相近，说明渗透压对HUVECs凋亡影响不大(Fig2)。
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Fig 2
Effect of EPT on high glucose-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells ( ± s,n=3)
1：Control; 2:Glucose 30 mmol·L-1; 3:+EPT 12.5 mg·L-1; 4:+EPT 25 mg·L-1; 5:+EPT 50 mg·L-1; 6:Mannitol 30 mmol·L-1,**P＜0.01 vs Glucose group.
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以OD405 反映caspase-3活性强弱。与正常对照组比较，高糖组caspase-3 活性明显升高(P＜ 0.01)。与高糖组比较，不同浓度EPT组内皮细胞caspase-3活性呈现剂量依赖性降低(P＜0.05或 P＜0.01)。甘露醇组caspase-3 活性与正常对照组相近，说明渗透压对HUVECs caspase-3 活性影响不大(Fig3)。
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Fig 3
Effect of EPT on high glucose-induced Caspase-3 activity in human umbilical vein endothelial cells ( ± s,n=3)
1：Control; 2:Glucose 30 mmol·L-1; 3:+EPT 12.5 mg·L-1; 4:+EPT 25 mg·L-1; 5:+EPT 50 mg·L-1; 6:Mannitol 30 mmol·L-1, *P＜0.05, **P＜0.01 vs Glucose group.
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与正常对照组比较，高糖组NF-κB p65 蛋白表达明显增加(P＜0.01)。与高糖组比较，不同浓度EPT组HUVECs NF-κB p65 蛋白表达呈剂量依赖性降低(P＜0.05 或P＜0.01)。渗透压对HUVECs NF-κB p65 蛋白表达影响不大(Fig4)。
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Fig 4
Effect of EPT on high glucose-induced protein expression of NF-κB p65 in human umbilical vein endothelial cells ( ± s,n=3)
1：Control; 2:Glucose 30 mmol·L-1; 3:+EPT 12.5 mg·L-1; 4:+EPT 25 mg·L-1; 5:+EPT 50 mg·L-1; 6:Mannitol 30 mmol·L-1,*P＜0.05, **P＜0.01 vs Glucose group.
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红色荧光为Cy3 标记的NF-κB p65 蛋白,蓝色荧光为DAPI 标记的细胞核双链DNA。与正常对照组比较，高糖组NF-κB p65 蛋白在细胞核中存在较多，说明NF-κB 被激活，发生核移位(P＜0.01)。与高糖组比较，不同浓度EPT 组HUVECs NF-κB p65 的激活、核移位呈剂量依赖性降低(P＜0.05 或P＜0.01)(Fig5)。
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Fig 5
Effect of EPT on high glucose-induced nuclear translocation of NF-κB p65 in human umbilical vein endothelial cells ( ± s,n=3)
1：Control; 2:Glucose 30 mmol·L-1; 3:+EPT 12.5 mg·L-1; 4:+EPT 25 mg·L-1; 5:+EPT 50 mg·L-1; 6:Mannitol 30 mmol·L-1,*P＜0.05, **P＜0.01 vs Glucose group.
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瓜蒌皮是用于治疗心血管疾病的有效中药，《中药志》中有记载瓜蒌皮可“宽胸散结、清化热痰，用治痰热咳嗽、心胸闷痛” [6]。动物实验表明，瓜蒌皮提取物能有效降低高脂血症大鼠血液中的TC 和LDL-C，改善氧自由基代谢，调节血脂，降低血小板聚集，抑制血栓形成，保护血管内皮[7, 8]。我们前期实验也证明，瓜蒌皮初提物对ox-LDL 诱导的人脐带静脉血管内皮细胞损伤有保护作用，其保护作用与抑制氧化应激，降低ADMA 和TNF-α 浓度，促进NO 的分泌有关[9]，同时也初步探讨了初提物对糖尿病大鼠血管内皮的保护作用[3]，但其机制尚未清楚。因此，本实验对瓜蒌皮有效成分做进一步分离，利用高糖诱导内皮细胞凋亡模型，对其机制做了进一步探讨。
内皮功能障碍是糖尿病血管病变的关键因素之一[10]。研究显示，高糖能诱导内皮细胞凋亡，影响血管内皮完整性，导致血管并发症[11]。本实验表明，体外培养的HUVECs 在高糖条件下48 h，细胞 活力明显下降，凋亡的细胞数明显增多。高浓度葡萄糖渗透压较高，为避免渗透压对实验的影响，设置了可以造成同等高渗状态的甘露醇组，实验表明高糖诱导的内皮细胞凋亡与其本身的代谢有关，而不是由于细胞外高渗状态刺激引起的。瓜蒌皮提取物干预后，能明显抑制高糖所致的细胞活力下降，并减少内皮细胞的凋亡，提示瓜蒌皮提取物对高糖诱导的内皮细胞凋亡有较好的抑制作用。
NF-κB是具有重要生理功能的转录因子，近年研究表明，NF-κB 在糖尿病血管并发症中扮演了重要的角色。Heng等[12]通过建立动脉粥样硬化高脂糖尿病大鼠模型研究发现，模型大鼠胸主动脉NF-κB 的mRNA 和蛋白表达明显升高，2型糖尿病小鼠冠状动脉内皮功能障碍也与AGE/RAGE 信号通路介导的氧化应激激活NF-κB 有关[13]。实验证明，NF-κB 的激活与氧化应激及细胞凋亡相关[14]，
同时，龙石银等[15]研究证实在H2O2诱导的内皮细胞凋亡中，NF-κB表达升高；间歇性高糖条件下也可诱导内皮细胞凋亡并激活NF-κB信号通路[16]。也有研究发现，在高糖作用下激活的NF-κB 还可使COX-2 表达上调，促进caspase-3 活化诱导内皮细胞凋亡[17]。本研究结果亦表明，高糖处理后，HUVECs NF-κB p65明显从细胞质移位与细胞核内，NF-κB p65 蛋白表达量明显增加，凋亡效应分子和执行者caspase-3 活性明显增加，细胞凋亡率明显升高。
瓜蒌皮提取物能明显减少高糖诱导的caspase-3 活性的增加，同时使NF-κB p65 蛋白表达以及NF-κB p65 核移位明显下降，并且能减少HUVECs凋亡率。说明瓜蒌皮提取物可能通过抑制核因子NF-κB 的活化，降低caspase-3 的活性，抑制HUVECs 凋亡，从而减轻高糖对内皮细胞的损伤作用，发挥保护血管内皮的作用。然而高糖对内皮细胞的损伤是一个复杂的过程，瓜蒌皮对损伤的保护作用，其相应机制以及临床应用价值都有待进一步深入系统的研究。
(致谢：感谢心血管研究湖南省重点实验室及心脑血管天然药物研究湖南省高校重点实验室对本实验给予的帮助。)
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