2. 首都医科大学基础医学院药理系, 北京 100069
2. Dept of Pharmacology, Capital Medical University, Beijing 100069, China
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年性痴呆的最主要形式，第1例报道见于1907年，主要表现为记忆力减退、认知功能障碍[1, 2]。其病理特征有细胞外存在淀粉样蛋白沉积(β-amyloid,Aβ)或称老年斑(senile plaques)、神经细胞内出现神经元纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT，主要成分为高度磷酸化的tau蛋白)、不同大脑区域的退行性改变(如基底前脑、杏仁核、海马和皮层等区域出现多种神经细胞丢失，尤其是胆碱能神经元)[2, 3, 4]。目前，治疗AD的药物主要是胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂，以及一些改善脑代谢的益智药物。但只能在早期缓解症状，无法阻止AD的病情进展[5, 6]，且不能有效改善AD患者脑部神经元的丢失[7]。据国际AD协会报道，到2050年，全球AD患者将增至1.15亿[8]，因此寻找更为有效的治疗药物迫在眉睫。
神经再生或神经重建，即利用干细胞的分化能力，分化成新的神经元和胶质细胞，主要指成年中枢神经系统内NSCs的存活、增殖和分化[9]。其研究范围大致有四个方面：①神经径路截断后的再接通，例如给予注入受损神经组织的神经干细胞以适当刺激，使之分化为神经组织的各种类型细胞，并对受损细胞进行修复，从而完成受损神经径路的再通；②神经细胞死亡后的神经细胞补充，即涉及到神经干细胞的移植；③中枢神经损伤后的神经保护，目的在于维持神经径路畅通及减少或预防神经细胞死亡；④神经辅助装置及神经康复器材的开发利用[10]。总之，整个神经再生的工作以神经干细胞移植治疗为中心，覆盖神经科及医学工程等各个方面，整体的研究结果应用于临床才能有效促进神经系统的再生。
干细胞具有自我更新和高分化潜能，为AD的治疗提供了新的思路。将体外扩增的神经干细胞移植到脑内，替代丢失或损伤的神经细胞，修复神经系统，是干细胞治疗AD的基本思路。治疗AD的干细胞来源主要有[11]：组织特异性干细胞，如神经干细胞(neural stem cells，NSCs)和骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs),还有胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs),和诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)等。干细胞治疗AD的可能机制是分化成神经样细胞，进而替换丢失或损伤的神经细胞、分泌营养因子、抗淀粉样蛋白生成、及作用于炎性细胞等[12]。以下就干细胞(NSCs、ESCs、MSCs、iPSCs等)移植治疗AD近几年的研究进展、机制及转化为临床运用的挑战作一综述。
1 干细胞移植治疗AD 1.1 神经干细胞(NSCs)NSCs主要存在于中枢神经系统，具有自我更新和多向分化潜能，体内外均可增殖并可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等细胞[13]，其迁移和播散能力强，作为细胞替代疗法，可弥补AD患者脑部丢失的神经元，是治疗AD的理想细胞供体[14]。Park 等[15]应用海人酸(Kainic acid,一种神经兴奋性毒剂)注射到SD大鼠脑部海马CA1区，引起其神经元大量丢失而建立学习记忆功能障碍的AD模型，将过表达乙酰胆碱转移酶的神经干细胞移植到AD大鼠脑室内，可明显改善海人酸诱导的AD大鼠的学习记忆障碍，并检测到AD大鼠脑脊液中乙酰胆碱水平明显升高。该结果显示AD患者中胆碱能系统功能紊乱是造成认知功能障碍的重要原因。在另一项研究[16]中也可得出相同结论，并且发现移植的NSCs可以迁移到不同的脑区(大脑皮层、海马、纹状体等)，并能分化产生神经元和星形胶质细胞。
NSCs不仅能够替代损伤或坏死的神经细胞而重建神经环路，NSCs还能通过促进神经营养因子的释放发挥神经保护作用。BDNF有助于神经存活，促进神经干细胞向神经元分化，促使其成熟[17]。Blurton-Jones等[18]利用3xTg-AD(过表达APP、早老素和tau蛋白的AD动物模型)研究NSCs移植对AD神经病理和认知功能障碍的影响，结果显示NSCs移植没有改变3xTg-AD小鼠中Aβ和tau蛋白的病理状态，而是通过增加3xTg-AD小鼠海马中的突触密度和BDNF的含量明显改善3xTg-AD小鼠的空间学习和记忆能力。
神经生长因子(nerve growth factor,NGF)可以增强基底前脑胆碱能神经元的存活和功能[19]。Lee等[20]利用ICR小鼠海马内注射鹅膏蕈氨酸造成大量神经元丢失而建立的AD模型，海马内移植过表达NGF的NSCs可以明显增强鹅膏蕈氨酸诱导的AD小鼠的学习记忆能力，并发现移植的NSCs能够转移到脑部不同区域，并分化产生神经元和星形胶质细胞。该研究表明，过表达NGF的NSCs可以改善AD小鼠的学习记忆缺失，另有研究也表明将过度表达乙酰胆碱转移酶的NSCs移植到18月龄♂ ICR小鼠脑中，移植4周后观察到老龄小鼠的认知能力和身体活动能力明显增强，脑内不仅乙酰胆碱水平升高，并且BDNF和NGF含量也明显性增加，同时TrkB及微管相关蛋白2(MAP2)表达升高[21]。该结果表明过表达胆碱转移酶的NSCs增加老龄鼠的认知功能和活动能力，不仅是通过升高乙酰胆碱的水平，也可能通过提高BDNF和NGF而恢复胆碱能神经的完整性。
1.2 胚胎干细胞(ESCs)ESCs是一种全能细胞，具有很强的增殖能力，并能分化产生各类细胞。体外对小鼠ESCs培养的研究表明，由ESCs分化而来的神经前体细胞(Neural progenitor cells,NPCs)在无血清培养条件下，可以扩增并分化产生神经元和神经胶质细胞[22]。直接移植ESCs到AD动物模型中会导致畸胎瘤的产生。但是Tang等[23]研究证实，移植ESCs来源的NPCs到AD模型鼠中，产生安全有效的治疗效果。实验中通过向Wistar大鼠的脑部齿状回中注射Aβ1-40而造成海马DG区大量神经元丢失，从而建立AD模型，将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的ESCs诱导分化产生的NPCs移植到Aβ损伤的海马中，结果显示NPCs能明显增强AD大鼠的空间认知功能并且不会导致肿瘤形成。
Wang等[24]将来源于小鼠ESCs的神经球移植到AD模型小鼠的额叶和顶叶皮层，空白对照组移植ESCs细胞，结果显示移植ESCs细胞神经球的AD小鼠学习记忆能力增强，并且在神经球移植的脑区乙酰胆碱能神经元增加，但是移植ESCs细胞的空白对照组小鼠的学习记忆能力反而下降，并发展成畸胎瘤。该研究证明移植ESCs细胞来源的神经球到前额叶和顶叶皮层能明显改善AD小鼠的胆碱能神经缺陷及记忆能力障碍，而ESCs细胞则没有此效果。Wicklund等[25]发现NGF能够促进人类ESCs细胞向胆碱能神经元和GABA能神经元分化。
此外，人类ESCs细胞不仅在治疗AD方面具有巨大潜能，并且也可用于AD发病机制的研究。例如Freude等[26]利用过度表达APP蛋白的人类ESCs细胞发现过度表达的APP能促进多能干细胞向神经细胞分化，实验中证实了APP水解产生的两个可溶性片段(αAPPs和βAPPs)能促使人类ESCs细胞的神经分化，并具有浓度依赖性。
1.3 骨髓间充质干细胞(MSCs)MSCs也称为骨髓基质细胞，在特定条件下能够被诱导分化产生各种细胞类型，像骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等[27]。所以MSCs可以作为移植治疗的细胞来源。Dezawa等[27]发现在MSCs中转染Notch胞内区域并随后给予营养因子培养，可使MSCs分化产生大量神经元。临床实验中多使用来自病人的骨髓间充质干细胞(autologous bone marrow MSCs,BMSCs)和脐带间充质干细胞(umbilical cord blood MSCs,UCB-MSCs)[12]。
不同于其他干细胞治疗AD，MSCs移植能够促进Aβ的清除。Lee等[28]将BMSCs移植到APP/PS1双转基因AD小鼠脑内，发现AD小鼠脑内Aβ沉积明显下降，并下调过度磷酸化tau蛋白的表达，明显增强AD小鼠的认知和记忆能力。该研究表明MSCs能够调节AD小鼠脑内的免疫炎症反应，减轻病理状态，并改善Aβ沉积引起的认知功能障碍。自噬途径可以降解功能障碍的细胞器或异常折叠的蛋白质，自噬系统功能紊乱会导致Aβ沉积。最近一项研究发现[29]将Aβ处理过的神经细胞与MSCs共培养，MSCs可以增强Aβ处理过的神经细胞的自噬作用，促进其Aβ的清除而表现出神经保护作用；在Aβ诱导的AD小鼠模型中，给予MSCs能明显促进AD小鼠自噬体的形成、成熟及与溶酶体的融合，降低AD小鼠海马中Aβ沉积，并增强海马神经元的存活。该结果表明MSCs能促进AD模型鼠中自噬溶酶体的形成和Aβ的清除。
Zhang等[30]从人类脐带中分离出成纤维样的细胞，并证实为脐带间充质干细胞(UCB-MSCs)。实验中发现人的UCB-MSCs在神经诱导培养基中培养14 d，并给予海马胆碱能神经刺激肽(hippocampal cholinergic neurostimulating peptide)，人的UCB-MSCs可以表达乙酰胆碱转移酶。表明人的UCB-MSCs可以分化产生功能性胆碱阳性细胞，人的UCB-MSCs可作为细胞移植治疗AD的细胞来源。
1.4 诱导性多能干细胞(iPSCs)iPSCs细胞是通过基因转染技术将4种转录因子Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc导入成人体细胞，使之重构成胚胎干细胞样的多潜能细胞[31]。ESCs移植会因供体和受体之间免疫系统的不兼容性而导致的免疫排斥反应，iPSCs直接来源于病人体细胞，理论上以iPSCs移植为基础的治疗方法不产生免疫排斥反应，也不会引发伦理问题。但是，Zhao等[32]利用移植性畸胎瘤模型发现，将来自于C57BL/6小鼠的ESCs同源移植到C57BL/6小鼠体内形成畸胎瘤模型而不会发生免疫排斥反应，相比之下，同源移植iPSCs在形成的畸胎瘤中可以明显观测免疫排斥反应造成的组织损伤和衰退。研究证明同源移植iPSCs可能引发T细胞依赖性的免疫排斥反应。而另一项研究发现[33]同源移植iPSCs分化产生的细胞，体外实验中并未检测到T细胞的增殖，也未诱发抗原特异性的二次免疫反应，该研究认为，自体来源iPSCs分化的细胞可用于细胞替代疗法而不会产生免疫排斥反应。这些研究表明在临床应用前检测iPSCs的免疫原性是非常关键的。
iPSCs直接来源于病人自身体细胞，可用于建造AD模型、研究AD细胞病理机制、并用作药物筛选平台。常染色体主导的早发型家族性AD(FAD)始发因素是PS1和PS2的突变，Yagi等[34]从在PS1(A246E)和PS2(N141I)位点突变的FAD病人的成纤维细胞中诱导得到iPSCs，并将其分化成神经元。实验发现，FAD-iPSCs分化产生的神经元中，Aβ42分泌明显增加。该研究证实了FAD-iPSCs来源的神经元可作为有效的FAD模型。利用来自于人的iPSCs作为AD模型，Yahata等[35]将人的iPSCs细胞分化成能表达APP蛋白、β-分泌酶、γ-分泌酶的神经细胞，该神经细胞可在条件培养基中分泌Aβ，实验中利用该神经细胞筛选3种抗Aβ的药物，即β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和非甾体类抗炎药物(NSAID)，结果发现3种药物对于分化38 d、52 d的iPSCs表现出不同效果，在分化38 d和52 d的iPSCs中，β-分泌酶抑制剂和NSAID均能够降低Aβ40和Aβ42的产生，并具剂量依赖性。但γ-分泌酶抑制剂在低剂量时即可明显降低分化38 d的iPSCs中Aβ的产生，而在分化52 d的iPSCs中γ-分泌酶抑制剂需要在更高剂量才能降低Aβ的产生。
Sproul等[36]获得在PS1(A246E)位点突变的FAD病人的成纤维母细胞，通过将4种转录因子Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc导入其中而产生伴有PS1突变的iPSCs(即PS1-iPS)，并由PS1-iPSCs细胞诱导产生NPCs，实验中发现，与相对应的空白对照组相比，在PS1-成纤维母细胞和PS1-NPCs中Aβ42/Aβ40的比值明显增加，并且Aβ42/Aβ40比值的增加在PS1-NPCs中更为明显；研究中利用指纹图谱技术分别对未分化的和分化14 d的iPSCs细胞进行研究发现，与空白组NPCs相比，在PS1-NSCs中鉴定出14个基因表达方式发生改变，其中在晚发型AD的病理大脑中通过实时定量PCR验证5个基因中有差异表达，尽管如此，要确定基因差异表达是否在AD中发挥重要作用仍需要在人类细胞和动物模型上得到进一步验证。
Duan等[37]将基因型为ApoE3/E4的散发性AD(SAD)患者(AD- E3/E4)的成纤维细胞诱导产生iPSCs作为SAD模型，将在PS1位点突变的FAD患者的成纤维细胞诱导产生iPSCs作为FAD模型，年龄相匹配的健康人的成纤维细胞诱导产生的iPSCs作为空白组。实验中将iPSCs诱导分化成基底前脑胆碱能神经元(basal forebrain cholinergic neurons,BFCNs)，结果中发现AD-E3/E4来源的BFCNs中Aβ42/Aβ40明显增加，即表现出AD患者典型的生化特征；在给予低剂量的γ-分泌酶抑制剂后，空白组和FAD的BFCNs中的Aβ分泌均下降，而AD-E3/E4的BFCNs中的Aβ分泌却上升；实验中还发现AD- E3/E4的BFCNs对神经毒性导致的细胞死亡更为敏感，在谷氨酸刺激下，AD-E3/E4的BFCNs胞内游离钙增加。
2 干细胞移植治疗AD所面临的挑战摇 2.1 选择最佳供体干细胞神经干细胞主要来源于胚胎、新生儿和成人的中枢神经系统，人类神经干细胞的来源有限且异体移植存活率低，均造成其数量受到限制，并引发伦理道德问题；以及如何在病变部位定向诱导NSCs分化为胆碱能神经元等问题也制约了NSCs用于AD临床治疗。尽管转染乙酰胆碱转移酶的人永生化的神经干细胞系(HB1.F3)移植到AD模型脑中，已被证明是安全有效的[16]，但临床应用人永生化的神经干细胞系治疗AD还需要进一步的研究和确认；此外，NSCs的供体(如供体年龄、胎龄或来自中枢神经的不同区域等)会严重影响NSCs为基础的细胞疗效[38, 39]，例如胎儿来源的NSCs和ESCs的增殖速度较成年NSCs快，而在分化成某一类型的神经细胞方面则是成年NSCs更具优势[38]。将患者的组织细胞诱导产生干细胞进行自体移植，是替代疗法中最有效、副作用最少的一种方法。最近研究发现，人的MSCs能够分化产生各种类型的细胞，并有研究证实MSCs体内移植能分化产生神经元和神经胶质细胞，但是目前诱导人的MSCs细胞产生神经系细胞的技术仍未发展成熟[39]。ESCs细胞因为具有多向分化潜能而被认为是细胞替代疗法重要的细胞来源，但是它涉及到的伦理问题、排斥反应以及导致畸胎瘤的产生，严重阻碍其在临床上的应用。iPSCs细胞由成人体细胞重组而得，可以最大程度避免免疫学的组织不相容性，然而技术限制，目前产生AD病人特异性的iPSCs细胞效率较低，并且临床应用iPSCs可能会像ESC一样导致肿瘤发生，这些都阻碍了以iPSCs为基础的细胞疗法在临床实验中的应用[40]，使iPSCs的研究仍处于基础实验阶段；此外AD病人的体细胞多已产生病理变化(尤其是FAD病人)，由AD病人体细胞诱导产生的iPSCs可用于AD模型研究AD病理过程，但很难作为自体移植细胞治疗AD。因此，人的ESCs和iPSCs作为供体细胞治疗AD前需进行一些基因修饰[41]。
2.2 干细胞的移植位点AD发病机制复杂，目前对于AD的病理发展过程还没有统一的认识，AD患者脑区各个部位都会产生损伤，包括颞叶、顶叶以及部分脑部扣带回和前额叶皮层等[4]，使得选择干细胞的最佳移植位点成为困难。干细胞治疗AD主要是通过替代AD患者脑部损伤或丢失的神经细胞，因此，将干细胞移植到脑部特定受损部位，并诱导分化为各种细胞类型是治疗的关键。Li等[42]研究发现，将ESCs来源的NPCs移植到Aβ损伤模型大鼠海马DZ区后能够迁移Aβ损伤并存活、分化成神经胶质细胞和能释放各种神经递质的神经元，并能促进突触功能的恢复。该研究与Tang等[43]的一项研究对比发现，将ESCs来源的NPCs移植到海马的DG区比将其移植到背侧海马区(大鼠的CA1区)产生更多种类和数量的神经元，并且移植的NPCs能迁移到颗粒细胞层。该结果表明海马DG区可能含有某些能诱导细胞分化或引导细胞迁移的因子。
2.3 干细胞是否整合入宿主脑部神经网络，形成有效的神经信号传导干细胞移植中不仅要考察供体细胞特点，在用于临床实验前，还要评估干细胞移植的治疗效果。很多研究表明[44]，干细胞移植在治疗神经退行性疾病中的疗效，很大程度取决于干细胞能否融入宿主的脑部中枢神经系统循环中去，并分化产生各种成熟细胞。Li 等[42]在实验中将移植的干细胞用绿色荧光蛋白标记，并将干细胞与一些神经细胞的特异性标记物相结合，从而检测出干细胞在体内分化产生的神经细胞。并且实验中还发现在移植细胞和宿主细胞之间有新突触的形成，这说明了移植的细胞可以修复AD患者受损的海马神经元。因此有效评价干细胞的功能整合对于其作为细胞疗法是非常关键的。
3 小分子化合物促进内源性神经再生神经再生即成年中枢神经系统内NSCs的存活、增殖和分化[9]，其过程主要包括NSCs增殖、存活和分化、新生神经元的成熟、突触形成和神经回路整合4个阶段[45]。大量研究表明[9, 45, 46, 47]，神经再生在哺乳动物脑内两个区域-海马齿状回的颗粒细胞下层和室管膜下区终生存在。尽管如此，随着年龄增长，哺乳动物脑内神经再生能力逐渐下降，这在AD患者中表现尤为突出[46]。研究发现神经再生损伤是AD小鼠模型的早期病发因素，Demars等[47]利用APPswe/PS1△E9-FAD小鼠模型发现，2月龄的模型小鼠即表现出严重的神经再生损伤，神经前体细胞增殖和分化能力明显下降，Demars等认为神经再生损伤可能是导致AD患者海马依赖性和嗅觉依赖性学习记忆能力下降的重要原因。Wang等[48]研究发现，3月龄的3xTg-AD模型小鼠中也表现出严重的神经再生缺陷，该研究认为早发于Aβ沉积的神经再生损伤是导致AD小鼠认知功能缺陷的主要原因。因此探讨促进脑内神经再生的化合物对于AD治疗有重要意义。近年来，国内外对小分子化合物调节神经干细胞增殖、迁移和分化的报道逐渐增多。
有研究发现芹黄素在体内和体外均能增强成年大鼠的神经再生，促进神经细胞分化，在水迷宫实验(Morris water task)中，芹黄素明显增强小鼠的学习记忆能力[49]。四氢孕酮能够促进AD小鼠神经干细胞增殖，增强AD小鼠神经再生和认知功能[48, 49, 50]。Jiang等[51]研究发现胡萝卜苷通过调节多种基因表达，尤其增强胰岛素样生长因子的表达，促进神经干细胞增殖，增强神经再生。原儿茶酸能够增强神经干细胞活力促进神经干细胞增殖，并且可以降低caspase-3活性，从而抑制神经干细胞凋亡[52]。抗抑郁药氟西汀体内能促进成年小鼠脑内海马区的神经再生[53]，体外可以增强神经干细胞增殖并促进其向神经元方向分化[54]。此外谷氨酸受体激动剂氨甲基膦酸、吡拉西坦及其类似物SGS111、哌嗪衍生物FK-960等均能促进成年人来源的神经干细胞的增殖和分化[55]。糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，有研究发现[56] GSK-3抑制剂在体外能够促进成年大鼠来源的神经干细胞的增殖、分化和迁移；在体内能够促进成年大鼠脑部海马齿状回区的神经再生。
因此，寻找能够促进神经干细胞增殖、迁移，并分化成特定脑区的神经细胞的小分子化合物，可能是今后AD药物研发的一个热点。
4 结论干细胞治疗作为AD的潜在治疗手段，越来越引起研究者的关注。近来的实验研究发现以干细胞为基础的细胞疗法不仅对AD，对其他的神经退行性疾病，如帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病等均具有广阔的治疗前景，研究NSCs、ESCs、MSCs、iPSCs等干细胞能帮助我们进一步研究与AD相关的病因病理，为建造AD模型提供更有效的方法。但是干细胞为基础的细胞疗法真正用于临床还需要一段很漫长的路，很多问题诸如干细胞移植入病人体内后具体会表现哪些作用，以及AD患者脑内环境是否会影响干细胞生物学功能等均需解决。随着干细胞生物学的深入研究和对AD疾病机制的进一步揭示，我们相信干细胞应用于AD的临床治疗会取得迅速发展。
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