蛇葡萄素 (ampelopsin) 是存在于葡萄科植物中的一类重要的黄酮类化合物。近年来的研究发现，蛇葡萄素具有体内外抗肿瘤、消炎镇痛、祛痰止咳、保肝护肝等作用^{[1, 2]}。蛇葡萄素钠 (ampelopsin sodium,AMP-Na) 是本实验室为了提高蛇葡萄素的溶解性及稳定性，使其成为更适合临床使用的药物剂型而制备的高水溶性钠盐。AMP-Na联合卡铂(CBP)后对肿瘤细胞的作用是否有改变，目前尚不确定，所以在前期实验的基础上，采用MTT法研究AMP-Na与CBP合用对人肺腺癌GLC-82细胞的细胞毒作用，应用流式细胞仪检测其对细胞凋亡的影响，初步探讨AMP-Na与CBP合用对GLC-82细胞增殖的抑制作用及机制。

蛇葡萄素钠(AMP-Na)冻干剂：每支50 mg，批号：051115，纯度98.8 %；AMP-Na冻干剂专用稀释液(0.1 mol·L^-1，pH=6.8磷酸盐缓冲液：每支5 mL，批号051118)，均由广东泰禾医药科技有限公司提供。卡铂：江苏齐鲁制药有限公司产品，批号：5090061 DA。新生小牛血清：杭州四季青生物工程有限公司产品，批号：050126。RPMI 1640培养基：Gibco Invitrogen Corporation，USA产品。MTT：Fluka公司产品，用pH=7.4的PBS配制成5 g·L^-1，过滤除菌分装，4℃保存(2周内有效)。

人肺腺癌GLC-82细胞，购自中科院上海细胞生物研究所细胞库。

CO₂培养箱：Shellab 2306、Shellab 2323 均为USA产品。超净工作台：SW-CJ-IFD 苏州净化设备有限公司产品。ELX800型酶联免疫检测仪：USA产品。流式细胞仪：Coulter Epics XL型，Beckman-Coulter Inc,Fullerton，CA,USA产品。倒置显微镜：OLYMPUS 产品。透射电子显微镜：JEN-100CX 日本电子公司产品。高速离心机：Anke TDl-5 上海安亭科学仪器厂产品。

取对数生长期(传代后24～48 h)的GLC-82细胞，用0.25 %的胰蛋白酶消化、离心(1 000 r·min^-1，5 min)，弃上清液，保留细胞沉淀，在细胞沉淀中加RPMI 1640培养液调整各细胞浓度至5×10⁷·L^-1，在96孔培养板中以每孔90 μL加入细胞悬液，培养24 h，待细胞贴壁后每孔加入药物10 μL，继续培养48 h。于实验终止前4 h每孔加入MTT 10 μL，实验终止时每孔加入10 % SDS 100 μL，置37℃、5% CO₂的培养箱中过夜，次日先震荡10 min，然后于波长570 nm处测定吸光值。根据下式计算抑制率和药物相互作用指数(CDI) ，并计算IC₅₀值。

本实验数据中阴性OD值为减去空白对照的值，受试药OD均值为减去颜色对照的值。药物相互作用指数(CDI)=

取对数生长期的GLC-82细胞，用含10 %小牛血清的RPMI 1640完全培养液调节细胞浓度1×10⁸·L^-1，以每瓶9 mL接种100 mL容量的6个培养瓶内，分别作为阴性对照组、卡铂对照(25 mg·L^-1)组、AMP-Na (50 mg·L^-1)单用组、AMP-Na (100 mg·L^-1)单用组、AMP-Na (50 mg·L^-1) + 卡铂(25 mg·L^-1)组、AMP-Na (100 mg·L^-1)+卡铂(25 mg·L^-1)组。培养24 h待细胞贴壁后，分别以每瓶1 mL加入药物或生理盐水，继续培养48 h。实验终止时，先将培养液离心(室温，1 000 r·min^-1,5 min)弃上清，保留细胞沉淀；再用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，在显微镜下观察当细胞间隙增大、胞质回缩、胞核变圆(约2～3 min)后，加含10 %小牛血清的RPMI 1640培养液中止消化，用吸管吹打均匀后将含细胞的培养液离心(1 000 r·min^-1,5 min)，混合所得细胞沉淀，制备样本，用Multicycle软件分析，计算凋亡细胞百分数和各细胞周期百分数及caspase-3的表达；用FACScan进行流式细胞术检测分析。

实验数据以表示，用SPSS 12.0进行统计分析。计量资料数据用多组均数t检验进行分析。

实验结果表明，AMP-Na对GLC-82细胞的增殖具有明显的抑制作用，有浓度依赖性。AMP-Na 50 mg·L^-1与卡铂系列浓度合用后，对GLC-82细胞的抑制率较两者单用时均增高，表明AMP-Na可以协同卡铂抗GLC-82细胞的增殖。见Tab1。

Tab 1 Inhibition effects and IC₅₀ of AMP-Na or combined with carboplatin on GLC-82 cells (, n=9)

表选项

Annexin-V-FITC/PI双标检测显示，药物作用48 h后，阴性对照组活细胞、凋亡细胞、坏死细胞占总细胞的百分比分别为(98.3±0.45)%、(0.53±0.13)%和(0.39±0.34)%。卡铂25 mg·L^-1处理组活细胞明显减少，凋亡细胞明显增多。100 mg·L^-1的AMP-Na单用组及与卡铂合用组，几乎没有活细胞，大部分细胞处于坏死状态，尚有部分处于凋亡状态(Tab2、Fig1)。

实验结果表明，100 mg·L^-1的AMP-Na作用于GLC-82细胞48 h后，大部分细胞处于凋亡和坏死状态。由于100 mg·L^-1的AMP-Na单独使用时就产生了强大的细胞毒作用，所以其与卡铂合用后对GLC-82细胞的作用与卡铂单用比较，无明显变化(P>0.05)。

Tab 2 Apoptosis and necrosis ratio of GLC-82 cells induced by AMP-Na or combined 48 h with carboplatin (，n=3)

表选项

Fig 1 Apoptotic rate of GLC-82 cells in different groups A: Control；B: CBP 25 mg·L-1；C: AMP-Na 100 mg·L-1；D: AMP-Na(100 mg·L-1)+CBP(25 mg·L-1)

图选项

卡铂25 mg·L^-1、AMP-Na 100 mg·L^-1处理GLC-82细胞48 h 后，caspase-3的表达均明显增高，与阴性对照组比较，差异有显著性(P<0.01)。AMP-Na 100 mg·L^-1与卡铂25 mg·L^-1联合用药组细胞，caspase-3的表达明显增高，与阴 性对照组比较，差异有显著性(P<0.01)，与卡铂25 mg·L^-1比较，无明显变化(P>0.05)。见Tab3、Fig2。

Tab 3 Expression of caspase-3 induced by AMP-Na or combined with carboplatin on GLC-82 cells (，n=3)

表选项

Fig 2 The expression of caspase-3 in different groups A: Control；B: CBP 25 mg·L-1；C: AMP-Na 100 mg·L-1；D: AMP-Na(100 mg·L-1)+ CBP(25 mg·L-1)

图选项

阴性对照组GLC-82细胞胞膜完整，微绒毛丰富，胞质中细胞器丰富，核膜清晰完整，染色质均匀分布(Fig3A)；卡铂处理组细胞胞膜完整，微绒毛减少，核膜清晰，线粒体扩张，胞质中出现大量空泡(Fig3B)；AMP-Na单用组，细胞表面光滑，微绒毛消失，细胞核固缩，核质比例增大，染色质凝集为团块状，分布与核膜边缘呈月牙状，细胞内出现大量空泡，线粒体肿胀(Fig3C)；AMP-Na与卡铂联用组，细胞膜表面的微绒毛明显减少，线粒体明显肿胀，染色质凝集并边集于核膜(Fig3D)。

Fig 3 Ultrastructure change of apoptotic GLC-82 cells with transmission electron microscope (48 h, ×10 000) A: Control；B: CBP 25 mg·L-1；C: AMP-Na 100 mg·L-1；D: AMP-Na(100 mg·L-1)+CBP(25 mg·L-1)

图选项

近年来肺癌已成为恶性肿瘤患者死亡的主要疾病,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌发病率的80%左右，预后较差，而化疗是晚期NSCLC的主要 治疗方法，以铂类药物为基础的联合化疗虽能改善晚期NSCLC患者的生存期、症状和生活质量，但其疗效已经达到了平台期^[3]，提高疗效关键在于推出高效低毒的新药。目前对于NSCLC的治疗，主张应用联合化疗,含铂方案目前是治疗晚期NSCLC的标准方案。但含铂方案有抗瘤谱窄、易产生耐药性等缺点，主要不良反应有骨髓抑制、消化道反应、脱发、肾毒性、肝毒性、神经毒性等^{[4, 5]}。由于以上原因，使得卡铂在临床上的使用受到限制。据国外报道，在临床上与卡铂协同用药可使预后差的许多肿瘤得到有效治疗^{[6, 7]}。所以找到一种与卡铂等化疗药物具有协同作用且低毒的药物，在提高其疗效的作用下，同时能大大降低其用药剂量，以克服其在临床使用中的不良反应、提高患者疗效是非常有意义的。本实验结果表明，50 mg·L^-1的AMP-Na单用，对GLC-82细胞的IR为(53.6±11.07)%。卡铂3.12～12.5 mg·L^-1单用的IC₅₀为(17.10±4.78) mg·L^-1。AMP-Na 50 mg·L^-1与卡铂3.12～12.5 mg·L^-1合用时，卡铂对GLC-82细胞的IC₅₀<3.12 mg·L^-1。表明50 mg·L^-1的AMP-Na对卡铂抑制GLC-82细胞增殖的作用具有协同效应，且主要对低、中浓度的卡铂协同作用较强。

随着科学研究的深入，人们发现凋亡在肿瘤的发生、发展上也起着重要作用。目前的抗肿瘤药物作用主要有直接杀死或抑制肿瘤细胞生长，以及诱导肿瘤细胞凋亡两个方面。而是否能引起肿瘤细胞凋亡又是评价化疗药物优劣的重要指标^[8]。本实验通过透射电镜观察可见，AMP-Na处理组及与卡铂联用组出现典型的凋亡相关的形态学变化，这说明AMP-Na可诱导GLC-82细胞凋亡，是其抗肿瘤作用机制之一。细胞凋亡的发生是一个极其复杂的过程，受多种机制调节和制约。凋亡发生机制中最关键的环节之一是caspase的激活，而caspase-3是目前已知与凋亡关系最密切的caspase家族成员之一。本实验结果表明，AMP-Na可以活化细胞内的caspase-3，而活化的caspase-3能裂解DNA修复相关分子、凋亡抑制蛋白、细胞外基质蛋白及骨架蛋白等，促使细胞凋亡。此外，由于caspase-3是多种凋亡途径共同作用的因子，其蛋白表达水平的高低决定着细胞凋亡程度^[9]。所以本实验结果提示，AMP-Na诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一可能是通过激活细胞内的caspase-3介导的信号转导通路，从而促进凋亡的发生。总之，细胞凋亡的发生是一个极其复杂的过程，有关AMP-Na诱导肿瘤细胞凋亡的机制还有待进一步研究。