表1(Table 1)
2. 贵阳医学院贵州省药物制剂重点实验室, 贵州 贵阳 550004;
3. 贵阳市妇幼保健院药剂科, 贵州 贵阳 550001
2. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics, Guiyang Medical University, Guiyang 550004, China;
3. Dept of Pharmacy, Guiyang Women and Children's Hospital and Health Institute, Guiyang 550001, China
血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的体外培养模型在生理学、病理学及药理学等领域都具有巨大的研究价值[1]，为人类对于中枢神经系统的认识提供了重大帮助。自从脑微血管内皮细胞(brain-microvessel endothelial cells,BMECs)首次在体外分离并培养成功以来[2]，体外BBB模型得到不断发展和完善，目前已有多种体外模型的相关文献报道[3]。由于BMECs的屏障功能随着体外培养时间及传代次数的增加而逐渐降低，甚至消失[4]，如跨内皮电阻值 (transendothelial electrical resistance,TEER)降低，通透性升高等，使得体外BBB的推广运用受到严重阻碍。研究发现，形成BBB并非BMECs的固有特性，中枢神经的内环境是形成BBB的必要条件[5]，而星形胶质细胞(astrocytes,AS)是第一个被认为具有调节和诱导BMECs形成BBB的关键因素[6]，鉴于此，BMECs与AS共培养模型是目前使用最为广泛的体外BBB模型。脑微血管周细胞(brain-microvessel pericytes,BMPC)是最靠近BMECs的一类细胞，其与BMECs共同拥有一个基底膜，但它对BBB的调节作用却很少被人们所关注[7, 8]。文献报道，BMPC在心血管的生成及BBB的调节方面均具有极其重要的作用[9, 10]。
本研究采用BMECs、BMPC及AS共培养建立一种新型的体外BBB模型，并对其进行屏障功能验证，为研究药物对BBB的影响及药物透过机制提供有力工具。
1 材料 1.1 动物2 d及10 d的 SD大鼠，♂♀均可，由贵阳医学院实验动物房提供，动物合格证号：SCXK黔2012-0001。
1.2 试剂DMEM高糖培养基(批号8114031)、胎牛血清(FBS，批号1227694)、胰蛋白酶(批号J130049)均购自Gibco公司；青霉素-链霉素(批号15140-122)购Hyclone公司；鼠尾胶原蛋白(批号C8062)、Trition X-100(批号T8200)、Percoll(批号305A046) 、苏木精(批号20130624)均购自Solarbio公司；胶原酶/分散酶(批号14093221)购自Roche公司；4%多聚甲醛(批号07K29C68)购自博士德生物公司；兔抗大鼠Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体(批号bs-2974R)、兔抗大鼠α-SMA单克隆抗体(批号bs-0189R)均购自Bioss公司；兔抗大鼠GFAP单克隆抗体(批号ab33922)、兔抗大鼠NG2多克隆抗体(批号ab83178)购自Abcam公司；D-Hanks缓冲液(自配)；SP免疫组化试剂盒(批号SP-9001)、DAB显色试剂盒(批号ZLI-9018)购自中杉金桥公司；Millicell insert(批号14070116)；碱性磷酸酶(AKP)试剂盒(批号A059-1)购自南京建成生物工程研究所；γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT1)ELISA试剂盒(批号ELA4289)购自R&D Systems公司。
1.3 仪器数显立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗仪器厂)；超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；CO2细胞培养箱(Thermo Scientific公司)；Allegra 64R 冷冻高速离心机(美国Beckman)；倒置显微镜(日本尼康公司)；THZ-100型恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司)； ERS-2电阻仪(美国密理博公司)；Cary Eclipse荧光分光光度计(美国VARIAN公司)； Modle 680酶标仪(Bio-rad公司)；Acugity-TDQ型超高效液相色谱-串联质谱(Waters公司)。
2 方法 2.1 大鼠BMEC的原代培养根据本实验室先前报道的方法[11]获得大鼠BMECs，体外BBB模型的建立均采用第二代的BMECs。
2.2 大鼠BMPC的原代培养依照大鼠BMECs的提取方法分离获得较纯的脑微血管段，用含有10%FBS的高糖DMEM培养基悬浮后，接种于鼠尾胶包被的培养瓶中，置于37℃、5% CO2培养箱内培养24 h后换液，以弃除死细胞残渣，随后隔天换液1次。延长培养至d 10后，用0.125%的胰酶 (含0.01% EDTA)消化，并于倒置显微镜下观察，待上层的BMECs及胶质细胞开始脱落，但BMPC未完全消化时弃除胰酶，用含有10%FBS的高糖DMEM培养基轻轻吹打细胞表面，将未脱落的BMECs及胶质细胞吹落。弃除培养基，用PBS缓冲液清洗2遍后，添加0.125%的胰酶 (含0.01% EDTA)继续消化，于倒置显微镜下观察，当发现细胞变圆，间隙增大时，弃除胰酶，加入6 mL含10%FBS的培养液终止消化，轻轻吹打至细胞脱落，接种于未包被的细胞培养瓶中培养，待细胞铺满培养瓶后按1 ∶ 2的方式传代。体外BBB模型的建立采用3~10代的BMPC。
2.3 AS的原代培养取5只新生1~2 d的SD大鼠，无菌条件下取脑，分离并收集灰质于冷DMEM培养液中。将收集到的大脑灰质用D-Hanks液清洗3次后，剪成1 mm3左右大小，加入0.25% (含0.02% EDTA)的胰酶，37℃振荡消化15~20 min，加入含10%FBS的高糖DMEM终止消化，800×g 离心5 min，弃上清液，将沉淀用含10%FBS的高糖DMEM培养液混匀，通过200目的滤网，将滤液接种于未包被的细胞培养瓶中培养(注：以上操作均在冰上进行)。50 min后吸出培养液，接种于事先涂有鼠尾胶的细胞培养瓶中。12 h后换培养液，以后每隔2~3 d换1次液。待细胞长成单层，将培养瓶置于恒温培养摇床中，200 r·min-1振荡15 h，吸出培养液，用PBS清洗2~3次，加入0.125%的胰酶(含0.01% EDTA)消化，在倒置显微镜下观察，当细胞变圆，间隙变大时，吸出胰酶，加入2~3 mL含10%FBS的高糖DMEM培养液，用滴管轻轻将细胞从瓶壁上吹打脱落，并吹成单个，按1 ∶ 2传代。体外BBB模型的建立采用3~10代的AS。
2.4 体外BBB模型的建立在模型建立之前，先用鼠尾胶原蛋白将24孔细胞培养板以及Millicell培养插的内侧和背侧包被并晾干。将BMPC及AS按每平方厘米1.5×104个细胞的密度分别接种于Millicell培养插的背侧和24孔细胞培养板中，于培养箱中培养6 h待BMPC及AS完全贴壁后，将Millicell培养插置于24孔细胞培养板中，将BMECs按每平方厘米2×104个细胞的密度接种于Millicell培养插的内侧，采用BMECs生长培养基培养。于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，每2 d换液1次，直至d 7模型成功。另外，为了探索最佳体外BBB模型，本研究共建立了5种不同类型的体外模型，如Fig1所示。
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| Fig 1 Diagram of five different types of in vitro BBB model |
将培养有BMECs、BMPC、AS的培养瓶置于倒置显微镜下观察细胞贴壁、生长状况及形态，并进行拍照。
2.6 免疫细胞组化染色将扩增培养的BMECs、BMPC、AS种于涂有鼠尾胶的6孔板中，当细胞铺满板底时吸出培养液，给予4%的多聚甲醛固定1 h，PBS冲洗3次(每次3 min)，按照SP免疫组化试剂盒说明书依次操作。其中BMECs采用兔抗大鼠Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体鉴定；BMPC采用兔抗大鼠α-SMA单克隆抗体以及NG2多克隆抗体鉴定；AS采用兔抗大鼠GFAP单克隆抗体鉴定。所有一抗均按1 ∶ 200稀释。DAB显色，苏木精复染，于倒置显微镜下观察，以胞质呈现棕色信号为阳性细胞，阴性对照用PBS代替一抗。
2.7 体外BBB模型屏障功能验证 2.7.1 TEER测定采用Millicell-ERS系统于d 7检测5种不同类型体外BBB模型TEER值，同时测量无细胞的空白Millicell培养插的电阻值作为基准值减去后，乘以培养插面积即为TEER(Ω·cm2)。
2.7.2 Na-FLU通透量测定待体外BBB模型培养至d 7后，用无血清的DMEM培养基清洗模型的内外侧2~3次，每孔内侧加入200 μL浓度为100 mg·L-1的Na-FLU无血清DMEM溶液，外侧加入1.2 mL无血清DMEM，60 min后从池外侧取出100 μL培养液用荧光分光光度计测定通过BBB模型的Na-FLU量，通过Artursson系数公式计算Na-FLU的通透性。
其中dQ/dt表示Na-FLU每分钟的通透量，A表示培养插的表面积，C0表示Na-FLU的初始浓度，60是将分钟换算成秒。
2.7.3 AKP的表达测定模型采用6孔Millicell培养插建立，待模型培养至d 7后，弃除内外池培养液，用PBS缓冲液轻轻漂洗模型2~3次，加入1%Triton X-100细胞裂解液0.5 mL，用移液器轻轻吹打，将单层BMECs吹落，转移至1.5 mL的EP管中，4℃下裂解60 min后离心10 min(12 000×g，4℃)，取上清液备用。按AKP检测试剂盒说明书方法检测。
2.7.4 γ-GT1的表达测定样品制备方法与“2.7.3”项相同，按γ-GT1 ELISA试剂盒说明书方法检测。
2.7.5 体外BBB模型与在体的相似性评价选用5个已知具有血脑屏障透过性的化合物作为阳性药进行体外BBB通透性测定，其体内数据如Tab1所示。测定方法为：待“EPA”模型培养至d 7后，用无血清的DMEM轻轻漂洗模型2~3次，每孔加入200 μL浓度为200 μmol·L-1的阳性药无血清DMEM溶液，外侧加入1.2 mL无血清DMEM，60 min后从池外侧取出100 μL培养液用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定阳性药通过BBB模型的量，通过Artursson系数公式计算其P<app，并与体内数据进行拟合，计算出相关系数。
色谱柱：Waters BEH C18 (2.1 mm×50 mm,1.7 μm)柱，保护柱：Waters Van Guard BEH C18 (2.1 mm×5 mm,1.7 μm)；流动相：A：0.1%甲酸乙腈(V/V)，B：0.1%甲酸水(V/V)，全梯度洗脱；流速：0.35 mL·min-1；柱温：45℃；进样体积：1 μL；质谱采用选择离子监测 (SIR) 扫描模式，以电喷雾离子源(ESI)在正离子电离模式下进行测定，以艾司唑仑为内标，用于定量的离子对分别为m/z 267.3(阿替洛尔)、m/z 455.6(维拉帕米)、m/z 189.2(安替比林)、m/z 195.2(咖啡因)、m/z 375.9 (羟嗪)、m/z 261.2(普萘洛尔)、m/z 295.2(艾司唑仑)；锥孔电压分别为：40 V、50 V、40 V、40 V、45 V、40 V、45 V、40V。
2.9 统计学分析结果以
表示，采用SPSS 11.5统计软件，进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间比较采用Dunnett法。
将原代培养的BMECs、BMPC、AS置于倒置显微镜下观察。BMECs呈典型的铺路卵石样结构，并呈漩涡状分布；BMPC胞体较大且呈分枝状；AS有细长突触，胞质较浅，如Fig2所示。
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| Fig 2 Cell morphology(×100)A: BMECs; B: BMPC; C: AS |
DAB显色后，胞质显棕色则为阳性反应。如Fig3所示，BMECs阳性表达Ⅷ因子相关抗原，AS阳性表达GFAP，BMPC阳性表达α-SMA和NG2，证明所分离细胞正确。
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| Fig 3 Characterization of primary cells by immunocytochemistry microscopy(×100) (A),(C),(E)is the negative control of BMECs,BMPC and AS respectively. BMECs express factor-VIII relative antigen(B), while astrocytes are positive for GFAP(D). Pericytes give a positive immunostaining for α-SMA(F) and NG2(G). |
如Fig4、Fig5所示，培养至d 7后，BMECs单层模型(E00)的TEER值最低，Na-FLU通透量最高，二元(EA0/EP0)和三元(EAP/EPA)共培养模型的TEER值明显高于(P＜0.01)且Na-FLU通透量明显低于(P＜0.05)单层培养模型。其中以三元共培养模型EPA最优，其TEER值为(478±25)Ω·cm2，明显高于EAP组(P＜0.01)，其Na-FLU的P<app为[(8.23±0.78)×10-6]cm·s-1，明显低于EAP组(P＜0.05)。
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Fig 4
Transendothelial electrical resistance of the different
in vitro blood-brain barrier models(,n=5)
**P＜0.01 vs E00 group; ##P＜0.01 vs EAP group
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Fig 5
Apparent permeability coefficient for sodium fluorescent of the different in vitro blood-brain barrier models(,n=5)
*P＜0.05,**P＜0.01 vs E00 group;#P＜0.05 vs EAP group
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培养至d 7后，BMECs单层模型(E00)的AKP及γ-GT1的表达均低最低，二元(EA0/EP0)和三元(EAP/EPA)共培养模型均可明显促进BMECs表达AKP(P＜0.01)和γ-GT1(P＜0.01)，其中以三元共培养模型EPA的AKP和γ-GT1表达最高，均明显高于EAP组(P＜0.01，P＜0.05),见Fig6、Fig7。
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Fig 6
Expression of AKP of the different in vitro blood-brain barrier models(,n=5)
**P＜0.01 vs E00 group;##P＜0.01 vs EAP group
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Fig 7
Expression of γ-GT1 of the different in vitro blood-brain barrier models(,n=5)
**P＜0.01 vs E00 group;#P＜0.05 vs EAP group
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如Fig8所示，6个阳性药在体外BBB模型中的P<app与体内实验数据相比具有较好的相似性，r2=0.92。
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| Fig 8 Correlation between P<app of drugs tested at thein vitro blood-brain barrier model(in vitro P<app)and the P<appof the same drugs measured in animal models(in vivo P<app) |
从上世纪80年代以来，体外BBB模型的建立一直是人们研究的热点，但到目前为止，还未有一个统一的标准来对其进行规范，导致用于体外BBB建立所用的细胞种类、种属来源以及模型指标等均具有较大差别。尽管如此，本研究采用同种属的BMECs与BMPC、AS共培养建立一个稳定、可靠 以及尽可能接近在体状态的体外BBB模型，并通过对一元模型(E00)、二元共培养模型(EA0/EP0)以及三元共培养模型(EAP/EPA)进行多个指标对比，以选出最优模型，为今后体外BBB模型的建立提供参考。
能否获得纯度较高的原代细胞是决定体外BBB模型质量的关键。本研究前期已建立了较为完善的BMECs分离及培养方法，而AS的分离较为简单，只需通过筛网过滤、差速贴壁及摇床振摇的方法即可纯化[13]。BMPC的贴壁能力较强，生长周期较长，对生长条件的需求相对于BMECs较低，因此，可通过培养条件选择以及延长培养的方法获得，并通过胰酶分步消化的方法去除贴壁能力较弱的BMECs、神经元细胞以及胶质细胞，最后接种于未经胶原包被的培养瓶中，使贴壁能力较弱的杂细胞不能贴壁生长而进一步纯化。
BMPC和AS均可诱导并维持BBB的功能特性，目前，BMECs与AS共培养模型被广大学者所采用，而BMECs与BMPC共培养模型也有文献报道[14]，但BMPC与AS对BBB的诱导作用是否具有协同促进作用，未见相关文献报道。本研究不仅对5种模型的TEER及Na-FLU进行测定，还对其特异性酶AKP和γ-GT1进行了验证。所有指标均表明，二元共培养模型优于一元模型，并且BMPC对BBB的调节作用优于AS；三元共培养模型优于二元共培养模型，说明BMPC与AS对BBB的诱导调节具有协同促进作用。此外，EPA模型的各指标均为最优，并且其与在体状态的解剖结构最为接近，是体外BBB的最佳模型。为了更直观地反映体外BBB模型与在体状态的相似程度，本研究采用6个具有BBB透过性的化合物进行体外筛选，并与体内数据进行比对，其相关性达0.92，表明本研究所建立的体外BBB模型与在体具有较高的相关性。
综上所述，采用大鼠BMECs与BMPC、AS共培养可建立稳定、可靠、功能和结构与在体相似的体外BBB模型，为BBB的生理病理研究以及跨BBB药物筛选提供了良好工具，并为今后体外BBB模型的建立提供参考价值。
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