氯米帕明是临床治疗重度抑郁常用的三环类药物之一，并用于强迫症、焦虑症治疗。其机制主要是抑制五羟色胺再摄取，同时也是组胺H₁受体、乙酰胆碱毒蕈碱受体和肾上腺素α₁受体的拮抗剂/反向激动剂，后三者效应与其不良反应直接有关^[1]。众所周知，氯米帕明在临床有好的治疗效果，但明显的副作用也影响它应用的安全性，如：增加癫痫发作、心脏毒性、认知损害、抗胆碱能不良反应、药物相互作用以及过量致死性等^[2]，在临床需个体化治疗，监测患者血药浓度是个体化用药的重要保证。

地西泮、奥沙西泮、氯硝西泮和阿普唑仑等苯二氮 类药物是临床广泛应用镇静催眠抗焦虑药，主要通过与苯二氮 受体结合发挥中枢神经系统抑制作用^[3]，奥沙西泮同时还是地西泮的活性代谢产物^[4]。这类药物与其它中枢药物联用已成为治疗神经系统疾病的常见手段，抑郁症、强迫症、焦虑症患者往往需要氯米帕明与这类药物合用，因患者的个体差异及其它因素，在增强疗效的同时，耐受性、依赖性及毒性可能有所增加^[5]。所以就更必要同时对它们进行监测。目前，有用高效液相色谱法^[6]、液质联用^[7]测定苯二氮 类药物及其代谢物，气质联用测安眠药^{[8, 9]}，液质联用测三环类抗抑郁药^{[10, 11]}，但用高效液相色谱法同时测定这几种药物国内报道罕见，且方法复杂^[12]。在测定方法中，目前国内对于血浆样品前处理方法有着明显的缺陷，大家采用的固相萃取多用C18固相萃取柱预处理血样^{[13, 14]}，这样对极性、非极性混合物同时萃取回收率偏低，降低测试灵敏度。本研究针对以上的需要与不足，建立用HPLC同时测定血浆中氯米帕明和4种苯二氮 类药物浓度的方法，并改进前处理萃取方法，以获得更高的回收率，提高灵敏度。

甲醇(北京百灵威科技有限公司)和乙腈(瑞典Oceanpak公司)为色谱纯，其它试剂为分析纯； 去离子水为Milli-Q50超纯水；地西泮、奥沙西泮、氯硝西泮、阿普唑仑， 氯米帕明和盐酸苯海拉明(内标)对照品(中国药品生物制品检定所)，空白血浆(汕头大学医学院第一附属医院血库)。

Agilent 1100高效液相色谱系统(包括四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器DAD、数据分析软件Chem Station for LC 3D Rev.A.10.01^[1635]，美国Agileng公司)；AL204电子天平(瑞士Mettle Toledo公司)；PHS-3CA精密酸度计(上海大浦仪器有限公司)；Anke TGL-16G高速低温冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；MS3涡旋仪(德国IKA 公司)；Milli-Q50超纯水仪(美国Millipore公司)。

分别精密称量地西泮、奥沙西泮、氯硝西泮、阿普唑仑、氯米帕明和内标对照品10 mg，用甲醇定容至10 mL，配制浓度为1 g·L^-1的标准品储备液，-20 ℃保存。浓度0.05 g·L^-1的工作液当天用流动相新鲜配制。所有溶液避光保存。

精密量取对照品地西泮、奥沙西泮、氯硝西泮、阿普唑仑和氯米帕明工作液(0.05 g·L^-1)，加入空白血浆，配制如下终浓度的标准曲线样品：氯硝西泮和阿普唑仑：5.0~200.0 μg·L^-1(5、12.5、25、50、100、200 μg·L^-1)；地西泮：10.0~500.0 μg·L^-1(10.0、31.25、62.5、125、250、500 μg·L^-1)；氯米帕明：20.0~500.0 μg·L^-1(20.0、31.25、62.5、125、250、500 μg·L^-1)；奥沙西泮：7.5~2000 μg·L^-1(7.5、50、125、250、500、1000、2000 μg·L^-1)。并配制各低中高浓度质控样品(QC)。

取固相萃取柱Bond Elut-C1(100 mg,1 mL) (美国Agilent公司)，依次用5 mL甲醇、超纯水活化；取500 μL 血浆，加入1 000 μL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，加入内标工作液50 μL，涡旋1 min混匀后上样至上述C1柱；分别用1 mL去离子水、1 mL水/甲醇混合液(80 ∶ 20，V/V)淋洗1次弃去；用2 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，45 ℃氮气吹干，复溶于125 μL流动相，离心后取上清液进样。

色谱柱Waters XTerra C8 RP(4.6 mm×150 mm，5 μm)，保护柱Agilent Zobax-Extend C18 (4.6 mm×10 mm，5 μm)；流动相50 mmol·L^-1 磷酸盐缓冲液(pH3.0):乙腈(73.2:26.8，V/V)；检测波长 220 nm，柱温45 ℃，流速1.2 mL·min^-1，进样量50 μL。

患者服用恒定日剂量药物2周后，于末次服药后12 h取血约1.2 ml，置于枸橼酸钠抗凝管，2 h内离心(1 400 r·min^-1，15 min)，取血浆存于-20 ℃待测。

取6份不同来源空白血浆500 μL，除不加内标外，其余按“2.3 血浆样品预处理”项下操作，获空白血浆色谱图A；将标准溶液和内标溶液加入空白血浆，依同法操作，获含药血浆色谱图B；由Fig 1 可以看出，成分间分离良好，未见血浆中杂质干扰。

Fig 1 Chromatograms obtained from (A) blank human plasma, (B) spiked human plasma with compounds (all in 100 μg·L-1). Peaks: 1: Oxazepam, 2: Alprazolam, 3: Clonazepam, 4: Clomipramine, 5: IS, 6: Diazepam.

图选项

将标准曲线样品按“2.3 血浆样品预处理”项下操作。以被测药物峰面积与内标峰面积之比为纵坐标Y，被测药物浓度为横坐标X，用最小二乘法进行线性回归，计算回归方程。LOD定义为信噪比≥3。从Tab 1可以看出，各药物在其线性范围内均呈现良好线性关系，相关系数均在0.9994及以上，LOD在1.4~5.5 μg·L^-1之间。

Tab 1 Calibration,limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) for clomipramine and four BZDs

Compound	Linearity range/ μg·L-1	Regression equation	Correlation coefficient/r	LOD/ μg·L-1	LOQ/ μg·L-1
	Y represents the peak area ratio of each drug to the IS,X represents the concentration of compound (μg·L-1)
Alprazolam	5.0-200.0	=0.0381X+0.0106	0.9999	1.5	5.0
Clonazepam	5.0-200.0	=0.0465X+0.0664	0.9994	1.4	4.8
Diazepam	10.0-500.0	=0.0153X+0.0141	0.9999	3.0	10.0
Clomipramine	20.0-500.0	=0.0291X+0.069	0.9995	5.5	18.5
Oxazepam	7.5-2000	=0.0496X-0.1334	0.9995	2.2	7.4

表选项

将“2.2”项下配制的QC样品，每个浓度进行5 样本分析，连续测定5 d，与标准曲线同时进行。根据当日标准曲线计算QC浓度，与配制浓度对比，求得本方法的精密度与准确度。结果表明(Tab 2)，被测化合物的日内误差(CV%) 为2.2%~12.6%，日间误差(CV%) 为2.1%~13.2%，偏差为-10.6%~14.6%。

取低中高浓度质控样品，重复测定5次，记录峰面积，与未经处理相应浓度药物标准溶液直接进样峰面积比较，计算提取回收率。被测药物及内标的提取回收率为81.1%~100.9%，见Tab 2。

Tab 2 Precision,accuracy and extraction yield results

a:Bias (%)=100×[(mean measured concentration)-(theoretical concentration)]/(theoretical concentration). b: Intra-day (n=5). c: Inter-day (n=5×5). d: Extraction yield (%)=analyte peak area compared to those obtained by injecting standard solutions at the same theoretical concentrations and the extraction yield values were calculated.

表选项

标准品贮备液-20 ℃冻存2个月稳定，含药血浆-20 ℃冻存2个月稳定，含药血浆冻融3次稳定，样品处理后4 ℃放置0、12、24 h稳定，未处理样品室温放置0、2、4 h稳定。

目前已对临床服用奥沙西泮、氯米帕明的患者进行了血药浓度检测，色谱图见Fig 2。

Fig 2 Chromatograms obtained from plasma samples in patients treated with (A) oxazepam; (B) clomipramine 1 :Oxazepam;4:Clomipramine;5:IS

图选项

本工作建立了在临床单用HPLC同时测定血浆中氯米[CM（25*2]帕明和4 种苯二氮〖XC卓.eps,JZ;P〗类药物浓度的方法，这对于科研实验 中采用液质联用或气质联用测定相比花费低、且操作简便，并可做到同时迅速、准确地一次性分别进行定性定量分析，可满足临床对血浆样品中此类药物含量测定要求。该方法在临床尤其实用，可在国内推广使用。

实验中观察了2种色谱柱：ODS₂(4.6 mm×250 mm，5 μm) 和 C8 (4.6 mm×150 mm，5 μm)。结果显示，前者C18柱不能完全分离5种被测物，且分析时间长，可能源于药物极性较小，在C18柱上保留时间长；而C8柱则能较好分离各组分，并缩短分析时间。流动相pH 值对色谱行为影响非常明显。在流动相摸索中，首先采用流动相水相pH 2.5、pH 4.3，发现峰展宽、拖尾、且分离不完全。我们又考察了不同的pH值，结果显示，pH 3.0效果最好，改善分离度及峰形，且具适当保留时间。

本工作的难点是样品的前处理，在血浆中，同时、高效提取氯米帕明和苯二氮 这两类药物并去除干扰是非常困难，但又是必须的。文献报道^[12]采用弱阳离子交换(WCX) 固相萃取柱进行血浆预处理，但洗脱时需分酸性和碱性洗脱层分别收集被测物，再分别进样，方法耗时、复杂，不适于临床应用。孙红雷等^[9]结果显示C18柱提取苯二氮 等安眠药效果最差，C2柱提取效果不均匀，而且去除杂质效果较差。乔静等^[15]测试了几种固相萃取柱对氯硝西泮的提取效率，结果显示Silica柱、C18柱及HLB柱的回收率均较低，为36%~73.5%。Shinozuka等^[11]结果显示，HLB柱对氯米帕明提取回收率仅为72.4%。我们根据以上报道，改进了萃取方法，采用了极性较大的C1柱，提高了极性及非极性化合物，即苯二氮 类及其活性代谢产物的回收率。改进的方法国内未见报道。

本实验中的另一难点是氯米帕明的回收率偏低。苯二氮 类药物pKa 1.5~3.5，为中性偏碱性药物。氯米帕明pKa 9.38，为弱碱性药物。两类药物pKa值相差较大，缓冲溶液pH值对提取回收率、降低杂质干扰有大的影响。当我们用去离子水(pH 5~6) 稀释血浆样品时，苯二氮 类药物均有90%左右的回收率，但氯米帕明的回收率始终仅略高于50%。为提高氯米帕明的回收率，实验中观察了pH 6.0、7.0和8.0磷酸盐缓冲液对提取回收率的影响，结果显示，用pH 7.0磷酸盐缓冲液稀释血浆样品，提取回收率达84%以上，且明显降低杂质干扰。但却对苯二氮 类药物回收率影响不大。经过以上方法的改进，处理后药物浓度富集为原来的4倍，大大地提高了方法的灵敏度。