表1(Table 1)
2. 沈阳师范大学粮食学院, 辽宁 沈阳 110034;
3. 安徽中医药大学, 安徽省中药研究与开发重点实验室, 安徽 合肥 230038
2. Shenyang Normal University College of Grain Science and Technology, Shenyang 110034, China;
3. Anhui Province Key Laboratory of Research and Development of Chinese Medicine, Anhui University of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230038, China
银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,GBE)是临床治疗脑血管疾病的一线药物，疗效得到国内外医学界充分肯定。银杏内酯B(ginkgolide B,GB)是GBE中重要的活性成分之一，GB是血小板活化因子(platelet activation factor,PAF)受体最有效的拮抗剂[1]，它可减轻脑缺血/再灌注介导的脑组织脂质过氧化反应，提高自由基清除系统酶的活性，对脑损伤有明显保护作用[2, 3]。
然而，GB的药代研究数据发现其在脑部浓度非常低[4, 5]，如：尾静脉注射GB (10 mg·kg-1) 20 min后脑部浓度仅为0.24 μg·g-1[4]。这里除了脑细胞对GB的清除效应外，其血脑屏障(blood brain barrier,BBB)对药物的屏障作用及BBB上P-糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)对药物的外排作用亦不容忽视[6]。因此，本实验室以提高GB脑靶向性、增强药效为目的，设计合成了一系列GB脑靶向前药[7, 8]，如酯类前药PGB(Fig 1)，它是在GB的10位羟基位置引入另一分子T而得到。T具有钙离子拮抗作用，同时对P-gp也具有一定的抑制作用。前期研究结果证实：PGB保留GB的抗血小板聚集活性[9]，同时增加了拮抗钙离子通道蛋白的作用[7]。
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| Fig 1 Chemical structures of GB and PGB |
PGB是作用于脑部而发挥药效的药物，所以对其脑靶向性评价及对脑缺血的保护作用研究尤为重要。为此，本文采用LC-MS/MS法，考察大鼠尾静脉注射PGB后的脑部药动学规律并评价其脑靶向性；采用颈动脉结扎致小鼠不完全性脑缺血模型，通过伊文斯蓝法考察PGB对缺血小鼠脑毛细血管通透性的影响。在证实PGB具有脑靶向作用的基础上，深入探究其靶向机制将为其它药物的脑靶向前药设计提供科学指导。
理论上来说，BBB通透性增加及P-gp外排功能减弱均有利于增加PGB的脑部浓度，从而提高其脑靶向效率。为此，我们采用摇瓶法，结合HPLC测定PGB在正辛醇-水体系的脂水分配系数(logP)，以此推测PGB的BBB通透性。P-gp结合力(亲和力)大小直接影响P-gp外排功能的强弱，在此，我们分别采用Molegro Virtual Docker (MVD)分子对接软件计算PGB、GB与P-gp的结合力大小；并以ATPase活性分析法测定PGB、GB对人P-gp膜ATP酶活性的影响，以考察它们与P-gp的亲和力。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 药品与试剂PGB为本实验室合成，其结构经IR、NMR、MS确证，纯度>99%；GB为合肥拓峰生物工程有限公司提供，纯度≥ 98%；盐酸维拉帕米为武汉拉那白医药化工有限公司提供，纯度99%；HPLC级甲醇购自美国Tedai公司；伊文斯蓝购自BIOSHARP公司；人P-gp膜购自美国BD公司；Tris、MES、DL-二硫苏糖醇(DTT)购自萨恩(上海)化学技术有限公司；甲酰胺、正钒酸钠、Mg-ATP、消泡剂A、SDS购自美国Sigma公司；其它试剂购自国药集团，均为分析纯。
1.1.2 仪器API 3200型三重四级杆串联质谱仪，配有电喷雾离子化源及Analyst 1.4.1数据处理软件，美国Applied Biosystem公司；高效液相色谱系统，配有515高压泵、2420蒸发光散射检测器(ELSD)、2487紫外光谱检测器(UVD)、Empower数据处理系统，美国Waters公司；Spectra Max M2e 多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司；标准PB-10酸度计，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；台式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；96孔细胞培养板，美国Corning公司。
1.1.3 实验动物SD大鼠，♀♂兼用，体质量(200±20)g，由安徽医科大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(皖)2005-001；SPF级昆明种小鼠，♂，体质量(20±2)g，由安徽医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(皖)2011-002。动物自由进食，饮水，标准颗粒饲料，室温(18~22)℃，实验前常规饲养1周。
1.2 方法 1.2.1 PGB脑靶向性评价 1.2.1.1 动物分组及给药SD大鼠随机分为PGB组(12.83 mg·kg-1)或GB组(10 mg·kg-1)，尾静脉注射给药，于给药后0.08、0.17、0.5、1、1.5、2、4、6、8 h时经大鼠眼底静脉丛采血，置于预先肝素化的试管中，4℃离心 (4 000 r·min-1，10 min)，精密吸取上层血浆，于-20℃保存，待测。取血后立即取出脑组织，用生理盐水洗净，滤纸吸干，称重后加入4倍量生理盐水(kg·L-1)制成脑匀浆，于-20℃保存，待测。
1.2.1.2 生物样品处理精密吸取血浆或脑匀浆190 μl，加入GA溶液(4 mg·L-1，内标)5.0 μL，混匀后加入乙酸乙酯1.0 mL，涡旋振荡3 min，4℃离心 (12 000 r·min-1，10 min)，取上层有机相，40℃水浴氮气流下吹干，残渣用400 μL流动相复溶，离心10 min，取上清液。其中血浆样品的上清液稀释10倍，脑匀浆样品不稀释，取10 μL进行LC-MS/MS分析。
1.2.1.3 测定条件[10]色谱条件：色谱柱：Waters Symmetry shield RP18 (3.9 mm×150 mm ID，5 μm)；流动相：甲醇-10 mmol·L-1乙酸铵溶液(85 ∶ 15，V/V)；流速：0.8 mL·min-1；柱温40℃；进样量10 μL。
质谱条件：电喷雾ESI离子源；负离子模式；多反应监测(MRM)扫描方式；电喷雾电压(IS)-4500 V；离子源温度(TEM)500℃；定量分析的离子对：PGB，[M-H]-，m/z 543.3/137.2；GB，[M-H]-，m/z 423.6→367.1和GA，[M-H]-，m/z 407.2→350.8。
1.2.1.4 脑靶向性评价[11]采用中国药理学会编制的3P97药代动力学分析软件，计算静脉注射药物后血浆及脑组织中的药代动力学参数，并以治疗有效性(therapeutic availability,TA)和靶向指数(drug targeting index,DTI)定量评价PGB的脑靶向特性。
式中：AUC表示药物从零时间至所有原形药物全部消除这一段时间的药-时曲线下面积。
AUCbrain(PGB)、AUCbrain(GB)分别表示注射PGB和原药GB后的脑内GB的AUC。
AUCblood(PGB)、AUCblood(GB)分别表示注射PGB和原药GB后的血浆内GB的AUC。
1.2.2 PGB对不完全性脑缺血模型小鼠脑毛细管通透性的影响SPF级小鼠按体质量均衡随机分为假手术组、模型组、GB组(5 mg·kg-1)、PGB高、中、低剂量(10、5、2.5 mg·kg-1)组。除假手术组、模型组外，其余各组均腹腔注射给药，给药容积为5 mL·kg-1，假手术组、模型组给予等容积的溶媒，每3 d称量体质量1次，根据体质量变化调整给药容量，连续腹腔注射7 d。
d 8各组小鼠用5.25%水合氯醛溶液麻醉，手术分离两侧颈总动脉，用动脉夹持续夹闭双侧颈总动脉20 min，打开双侧动脉夹，缝合颈部皮肤。休息2 h后由尾静脉注射2.5% 伊文斯蓝溶液 (10 mL·kg-1)。注射1 h后，将小鼠颈椎脱臼处死，开颅取脑，将脑组织浸于生理盐水中清洗，滤纸吸干，准确称重，将脑组织浸泡于脑质量10倍体积(kg·L-1)的甲酰胺中，45℃培养箱温育72 h，12 000 r·min-1离心20 min，取上清液，于620 nm处，酶标仪测光密度(OD)值。
1.2.3 PGB脂水分配系数测定[12] 1.2.3.1 测定条件色谱柱：Symmetry shied C18柱(250×4.6 mm,5 μm)；测定GB时的其它色谱条件：流动相：甲醇-水-四氢呋喃(30 ∶ 60 ∶ 10，V/V)；流速：0.8 mL·min-1；柱温：25℃；蒸发光散射检测器，氮气25 psi，增益值100，漂移管60℃，蒸发器级别60%。
测定PGB时的其它色谱条件：流动相：甲醇-水(55 ∶ 45，V/V)；流速：0.8 mL·min-1；柱温：25℃；紫外检测波长275 nm。进样量均为10 μL。
1.2.3.2 样品配制精密配制浓度为1.0及 0.1 g·L-1的PGB、GB正辛醇(二次蒸馏水饱和)溶液，避光保存，备用。
1.2.3.3 平衡时间确定分别取0.1、1.0 g·L-1 PGB正辛醇溶液10 mL于锥形瓶中，加入10 mL二次蒸馏水(正辛醇饱和)混合振荡。分别振荡1、2、3、4、5、6 h后，分离水相和有机相，检测水相中PGB浓度。当浓度不再增加时，即为平衡时间。同法确定GB正辛醇溶液的平衡时间。
1.2.3.4 脂水分配系数测定分别取0.1 g·L-1 PGB或GB正辛醇溶液10 mL与10 mL二次蒸馏水(1 ∶ 1)混合，25℃下振荡3 h (根据1.2.3.3结果确定)；另取1.0 g·L-1 PGB或GB正辛醇溶液10 mL与50 mL二次蒸馏水(1 ∶ 5)混合，25℃下振荡5 h(根据1.2.3.3结果确定)。上述各溶液振荡后分离有机相和水相，分别测定两相中PGB、GB浓度。
正辛醇/水分配系数以log P表示，其计算公式为：
式中：Co表示化合物在正辛醇中的浓度，Cw表示化合物在水相中的浓度。
1.2.4 PGB与P-gp结合力的分子对接计算 [13]采用MVD软件模拟配体分子与受体蛋白的结合力或亲和力。这里的受体蛋白为P-gp，它的晶体结构[14]来源于蛋白质数据库(protein data bank,PDB)的鼠P-gp PDB code：3G5U)；配体分子选择PGB、GB、T 和维拉帕米(verapamil,Ver)。T分子是PGB结构(Fig 1)中具有P-gp抑制作用的活性分子；Ver是一种常用的P-gp抑制剂，可激活P-gp的ATP酶活性。在分子对接过程中，采用准确性较高的MolDock打分算法，MolDock Score 绝对值越大，配体分子与P-gp结合力越大。结合力越大，越易被P-gp外排，从而可以使同时存在的其它分子的外排受到抑制。
1.2.5 PGB对人P-gp 膜ATP酶活性的影响[15, 16] 1.2.5.1 溶液配制反应基质液：称取EGTA 75.8 mg、KCl 187.3 mg、DTT 31.2 mg、NaN3 32.5 mg溶于100 mL Tris-MES 缓冲液(PH 6.8)得到反应基质液。
标准Pi溶液：称取NaH2PO4 30.0 mg溶于10 mL反应基质液得到3 g·L-1的NaH2PO4储备液。用反应基质液稀释至0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05 g·L-1，即为标准Pi溶液。
药物溶液：(1) PGB或GB溶液：分别称取8.2 mg PGB 或6.4 mg GB，用反应基质液溶解并定容至10 mL，配成1 500 μmol·L-1的PGB或GB母液，并稀释至750、300、150、30 μmol·L-1；(2) Ver溶液：称取7.4 mg盐酸维拉帕米，用反应基质液溶解并定容至10 mL，配成1 500 μmol·L-1的Ver母液，并稀释至750、300、150、30 μmol·L-1。
P-gp膜溶液：取人P-gp膜母液 (5 g·L-1)于37℃水浴快速解冻，用反应基质液稀释至1 g·L-1，置于冰上待用。
正钒酸钠工作液：称取正钒酸钠27.5 mg溶于5 mL反应基质液，取其中的100 μL溶液用反应基质液稀释至10 mL，得到300 μmol·L-1的正钒酸钠工作液。
Mg-ATP液：称取Mg-ATP 31.2 mg，溶于5 mL反应基质液，得到12 mmol·L-1的Mg-ATP溶液。
反应终止液和显色液：称取SDS 1.01g溶于10 mL蒸馏水，加入20 μL消泡剂A，配成SDS质量分数为10%含0.2%消泡剂A的反应终止液；称取钼酸铵432.6 mg、醋酸锌27.5 mg，用蒸馏水溶解并定容至10 mL得到显色剂A。称取抗坏血酸4 g，溶于36 mL蒸馏水，配成质量分数为10%抗坏血酸溶液，此为显色剂B。使用时两种溶液以1 ∶ 4 (V/V)混合作为显色剂。
1.2.5.2 试验分组非P-gp ATP酶活性组(正钒酸钠+P-gp膜)；阳性对照组(Ver系列浓度+P-gp膜)；试验组(GB或PGB系列浓度+P-gp膜)。
1.2.5.3 反应孵育条件反应在96孔板中进行。P-gp膜溶液和试验药物溶液各20 μL，在37℃培养箱中预热5 min，随后加入20 μL 37℃预热5 min的Mg-ATP溶液，开始反应。另将含有正钒酸钠的反应液作为对照，以排除P-gp制作过程中非P-gp ATP酶活性和非酶作用的ATP水解的影响。该反应液(60 μL)在37℃孵育相应时间，之后每孔加入30 μL反应终止液，再加入200 μL显色剂(含40 μL显色剂A和160 μL显色剂B)，37℃孵育20 min，多功能酶标仪在620 nm处测吸光度。
1.2.5.4 Pi标准曲线将配制好的0~0.3 g·L-1标准Pi溶液接种于96孔板上，每孔60 μL，每个浓度平行5孔，37℃孵育30 min后，加入30 μL反应终止液，其余按1.2.5.3项下处理。
1.2.5.5 时间-ATP酶活性实验根据试验分组，分别在96孔板中加入正钒酸钠工作液、300 μmol·L-1 Ver溶液、300 μmol·L-1 GB溶液或PGB溶液各20 μL，每组平行3孔。随后每孔加入稀释后的P-gp膜溶液20 μL，37℃培养箱中预热5 min，最后加入37℃预热的Mg-ATP溶液20 μL，混匀后37 ℃分别孵育0、15、30、45、60 min。其余按1.2.5.3处理。根据Pi标准曲线求算反应释放的无机磷量，绘制ATP酶活-时间曲线。
1.2.5.6 浓度-ATP酶活性实验根据试验分组，分别在96孔板中分别加入正钒酸钠工作液、Ver、GB、PGB系列工作液(1500、750、300、150、30 μmol·L-1)各20 μL，每一浓度平行3孔。随后每孔加入稀释后的P-gp膜溶液20 μL，在37℃培养箱中预热5 min，再加入37℃预热的Mg-ATP溶液20 μL，混匀后37℃孵育60 min(根据1.2.5.5结果确定)，之后按1.2.5.3处理。根据Pi标准曲线求算反应释放的无机磷量，绘制ATP酶活-药物浓度曲线。
1.2.5.7 数据处理将所测得的ATP酶活性数据代入米氏方程
其中，V和Vmax分别为药物激活的ATP酶活性及其最大值，Km为米氏常数，即ATP酶活为最大值一半时的底物浓度；C代表底物浓度。
1.3 统计学方法 所有实验数据均以
表示，采用SPSS 18.0进行F检验。
大鼠尾静脉注射PGB，给药5 min后在脑匀浆中即检测到PGB以及PGB降解的GB。与直接注射GB(以GB0表示)相比，注射PGB后在脑匀浆检测到的GB(以GB(PGB)表示)浓度均有较大幅度提高。注射PGB或GB后，在血浆和脑匀浆检测到的药物浓度数据以及它们的药动学参数列于Tab 1和2。由“1.2.1.4”下的公式计算TA为6.87，DTI为4.14，这表明将GB改造成PGB后，PGB可以迅速通过BBB，且脑靶向性大大提高。同时，我们也观察到PGB降解GB的脑内半衰期(T1/2)延长，清除率(CL)下降，PGB呈现出一种长效缓释特性，这对于脑血管疾病的长期用药是非常有利的。
, n=6)
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小鼠腹腔注射连续给药7d后，模型组与假手术组相比，伊文斯蓝通过小鼠脑毛细血管的量明显增加，这说明不完全性脑缺血小鼠模型复制成功(P<0.05)，如Tab 3所示。GB给药组的伊文斯蓝透过量与模型组相比有所减少，但其差异无统 计学意义；而PGB低、中、高剂量组的伊文斯蓝透过量均低于模型组，且呈现一定的剂量依赖性，其中PGB高剂量组的降低程度最为明显，差异具有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明，PGB对不完全性脑缺血小鼠的保护作用强于GB，这可能也得益于PGB的脑靶向性提高。
PGB的脂水分配系数测定结果见Tab 4。由表可知，将GB制成前药PGB后其亲脂性增强(logP=1.03)，更易穿透BBB到达脑部。
各配体与P-gp的分子对接计算结果见Tab 5。由MolDock Score计分数据预测配体分子与P-gp的结合力，其结合力大小排序为：PGB ＞GB ≥Ver＞T。PGB与P-gp结合力大于GB，即当脑内同时存在PGB和降解的GB时，PGB由于结合力大优先被外排出脑，从而减弱了P-gp对GB的外排作用，最终使GB的脑内浓度升高。
| Drugs | MolDock score/ KJ·mol-1 | Rerank score/ KJ·mol-1 | HBond/ KJ·mol-1 |
| PGB | -143.36 | -94.63 | -6.44 |
| GB | -116.40 | -82.98 | -9.02 |
| T | -64.40 | -53.82 | -8.39 |
| Ver | -110.35 | -86.28 | -0.11 |
在0~0.2 g·L-1的浓度范围内，无机磷吸光度(A)与NaH2PO4浓度线性良好(Fig 2)，且覆盖了整个待测样本的浓度范围。
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| Fig 2 Standard curve of inorganic phosphate concentration |
结果显示，PGB、GB、Ver诱导的P-gp ATP酶活性存在时间依赖性。随着时间延长，各种药物依赖的ATP水解释放的无机磷量均增多，且无机磷释放量与时间之间呈现较好的线性关系(Fig 3)。为达到最大灵敏度，选择60 min作为药物与P-gp膜作用时间，此时的吸光度均在Pi浓度测定标准曲线的线性范围之内。
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| Fig 3 Time dependency of substrate induced P-gp ATPase activity as measured by inorganic phosphate released by three drugs |
PGB是一种兼具PAF受体拮抗和钙离子拮抗作用的新型GB前体药物，本研究证实了PGB具有较优的脑靶向性，其以治疗有效性(TA)和靶向指数(DTI)评价的脑靶向效率达6.87和4.14。
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| Fig 4 Concentration dependency of substrate induced P-gp ATPase activity as measured by inorganic phosphate released by three drugs |
药物有无脑靶向性关键有两点：一是药物能跨越BBB大量入脑，二是入脑药物不被外排出脑。跨膜输入依赖于药物对BBB的通透性，BBB通透性通常取决于药物本身的相对分子量、脂溶性以及特定的载体或受体转运系统等。BBB上存在的P-gp外排泵，能将许多脂溶性好、易透过BBB的药物外排出脑组织，所以减少输出需降低P-gp的外排泵效能。
正辛醇-水体系的分配系数是预测药物透膜转运能力的重要指标。本研究通过摇瓶法结合HPLC测得PGB的logP数值(1.03)高于GB (0.61)，这说明将GB改造为PGB后脂溶性增强，更易于跨越BBB到达脑部，使脑内可供降解为GB的PGB量上升。这一推测在尾静脉注射PGB后GB脑内浓度检测(Tab 1)中得到了较好地证实。
P-gp 对药物外排作用具有竞争性和ATP依赖性，本实验中，我们采用了分子对接软件预测PGB、GB与P-gp的结合力，以此分析它们被P-gp外排的优先性；研究PGB、GB对人P-gpATP 酶活性的影响，以此分析它们对P-gp外排功能的抑制作用。分子对接计算结果提示，PGB与P-gp的结合力高于GB； PGB、GB对人P-gp膜 ATP酶活的测定结果表明：二者均能提高P-gp ATP酶活，阻断P-gp介导的其它药物外排，但PGB比GB具有更高的亲和力，即PGB对P-gp的外排抑制作用更强，上述结果表明，当脑内同时存在PGB及PGB降解的GB时，PGB由于亲和力强易被外排出脑，从而有效减弱或阻断P-gp对GB的外排，最终使GB的脑内浓度升高，在一定程度上增强了GB的脑靶向性。
综上所述，PGB的脑靶向作用主要得益于较高的脂溶性和对P-gp的强抑制作用。以上研究结果提示：增大药物的脂溶性(logP)及药物与P-gp 亲和力可在一定程度上实现脑靶向给药，这对于脑靶向前药设计提供一种新的设计策略，即可以借助计算化学的logP 计算和分子对接的P-gp亲和力预测来设计筛选脑靶向前药。
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