骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种以骨量低下，骨微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性代谢性骨病。随着衰老“自由基理论”[1]的广泛应用，氧化应激效应能够抑制骨髓干细胞分化为成骨细胞，促进破骨细胞分化，并通过降低骨量与骨强度而影响骨组织衰老进程，从而加剧骨质疏松的发生与发展[2]。辅酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)属于脂溶性醌类化合物，在人体的心、肝、肾、胰腺中均有存在，其生理作用是在线粒体内氧化磷酸化反应中起辅酶作用。近年来的研究发现，CoQ10除了在细胞呼吸链中的生理功能外，还具有强大的清除自由基作用，机体摄入外源性CoQ10，可以起到体内抗氧化、延缓衰老的功效。最新的研究[3, 4]发现，CoQ10在减少活性氧自由基表达的同时，抑制破骨细胞的形成，增加骨形成特异性相关的转录因子Osterix的表达，提示CoQ10可参与调节骨代谢，抑制骨质疏松的发生发展。本研究用环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)快速诱导大鼠骨质疏松模型，采用骨生物力学和micro-CT等技术，观察CoQ10对CTX大鼠股骨松质骨微观结构和生物力学性能的影响，并与阿仑膦酸钠(alendronate，ALD)的效果进行对比，为进一步开发CoQ10抗骨质疏松的应用提供依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物32只♂2 mon SD大鼠，体重(276.8±19.6)g，由南方医科大学实验动物中心提供，SPF级，动物合格证号：SCXY(粤)2011-0015。
1.2 药品与试剂CoQ10(药用原料药)：由广东润和生物科技有限公司提供，使用时用少量吐温80(化学纯，批号20100722，天津市福晨化学试剂厂)促溶后用生理盐水调整到实验室所需浓度。ALD：石药集团欧意药业有限公司，批号：007130901。环磷酰胺：江苏恒瑞医药有限公司，批号：13032725。Micro CT仪(viva CT40；SCANCO Medical AG)。858 Mini Bionix 型材料测试系统(MTS,USA)。
1.3 实验动物与分组2 mon龄SD♂大鼠32只，适应性饲养2周后，按体重对等原则随机分成4组，每组8只。A组为正常对照(CON)组:该组大鼠每天灌胃给予生理盐水(5 ml·kg-1·d-1)；B组为环磷酰胺(CTX)组，该组大鼠每天灌胃给予CTX (4.5 mg·kg-1·d-1)；C组为阿仑膦酸钠(ALD)组，该组大鼠每天灌胃给予CTX (4.5 mg·kg-1·d-1)及ALD (1 mg·kg-1·d-1)；D组为辅酶Q10(CoQ10)组：该组大鼠每天灌胃给予CTX (4.5 mg·kg-1·d-1)及CoQ10 (30 mg·kg-1·d-1)。4组动物均自由饮水和进食标准饲料。实验共给药15 d，每周称取体重1次，实验结束时，用40 g·L-1戊巴比妥钠(1 mL·kg-1)行腹腔注射麻醉后右心室彻底抽血处死，取右侧股骨进行生物力学检测，之后再取干骺端进行micro-CT扫描和三维重建。
1.4 骨生物力学检测[5] 检测时，将-20℃保存的股骨常温解冻，生理盐水复湿。用858 Mini Bionix型材料测试系统监测和分析大鼠右侧股骨的生物力学性能。将股骨置于流变仪上分别进行三点弯曲实验，加载速度为0.01 mm·s-1，跨距为15 mm。量取骨干正中的内外径，由载荷，桡度换算并绘制应力-应变曲线，从曲线上读取及计算最大强度(maximum strength)、断裂强度(break strength)、断裂应变(break strain)、弹性模量(elastic modulus)、刚性系数(modulus of rigidity)及韧性系数(toughness index)等骨材料学评价指标。
1.5 Micro CT 测量将处理好的右股骨远心端(已截断)标本沿长轴垂直固定于样品固定器内，viva CT 40选择扫描参数：图像矩阵为1024×1024，整合时间(integration time)为200 ms，能量／强度为70 kVp、114 μA、8W。以0°旋转，进行扫描。扫描完成后，选取距生长板远端1.0 mm、层厚3.0 mm的骨组织为松质骨感兴趣区域(region of interest，ROI)行三维重组，以最低阈值为190提取图像信息。获得重组图像后，使用Micro CT自带的软件进行定量分析。物理参数分析如下：骨密度(bone mineral density，BMD)、骨体积分数(bone volume/total volume，BV/TV)、结构模型指数(structure model index，SMI)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)
1.6 数据处理 参数值用
表示，采用SPSS 17.0软件对数据进行方差分析及组间比较。
与CON组相比，CTX组大鼠股骨的最大强度、断裂强度、断裂应变及韧性系数均明显下降，同时刚性系数明显增加(P＜0.05，P＜0.01)，股骨脆性增加，抗冲击和抗断裂能力均下降。与CTX组相比，ALD组大鼠股骨的断裂应变和韧性系数明显增加，刚性系数明显降低(P＜0.05，P＜0.01)，股骨脆性降低，韧性增强，但抗骨折能力无增强；CoQ10组大鼠股骨的最大强度、断裂应变和韧性系数均明显，而弹性模量和刚性系数下降(P＜0.05，P＜0.01)，股骨韧性增加，脆性减弱，抗冲击和抗变形能力明显增强。见Tab1。
与CON组相比，CTX组大鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明显降低(P＜0.01)，而SMI和Tb.Sp明显增加(P＜0.01)，小梁骨结构由板状向杆状变化。与CTX组相比，ALD组大鼠股骨的上述指标均得到了很好的逆转(P＜0.05，P＜0.01)；CoQ10组大鼠股骨BV/TV和Tb.Th有明显增加(P＜0.05，P＜0.01)，但其他指标仅有一定的改善趋势(P>0.05)。见Tab2。
Micro-CT可视化成像结果形象地展示了各组大鼠股骨远心端松质骨的形态变化情况。
CON组大鼠股骨走向一致，结构紧密，粗细均匀，连续性良好；CTX组骨小梁稀疏、细小、排列不均，出现大片无骨小梁骨髓区，呈现出明显的骨微结构破坏；ALD组骨小梁致密，松质骨量较CON组仍有明显增加，但排列混乱，走向无序；CoQ10组骨小梁排列均匀，走向有序，骨小梁数量较CTX组有所改善，但仍少于CON组。见Fig1。
|
| Fig 1 Micrographs of the vertical section of distal femur in different groups of rats A:CON; B:CTX; C: ALD; D:CoQ10.Less trabecular bone and poor trabecular structure could be seen in CTX group compared with CON group．Both alendronate and CoQ10 drug treatment could improve trabecular microstructure compared to CTX group. |
与CON组相比，CTX组小梁骨结构明显疏松，网状结构退化、呈现出明显的骨微结构破坏，部分不能保持完整的微观构筑；与CTX组相比，ALD组和CoQ10组小梁骨的数量和结构均有明显修复，特别是ALD组小梁骨数量巨大，排列紧密，几难见空隙。见Fig2。
|
| Fig 2 Segmented(SEG) image of micro-CT of distal femur in rats of different groups A:CON; B:CTX; C: ALD; D:CoQ10.Less trabecular bone and poor trabecular microstructure of femur could be in CTX group compared with control group. Both alendronate and CoQ10 drug treatment could improve trabecular microstructure compared to CTX group. |
与CON组相比，CTX组红色、黄色部分减少，说明骨小梁变薄；与CTX组相比，ALD组和CoQ10组红色和黄色部分明显增多，说明厚度明显增加。见Fig3。
|
| Fig 3 Trabecular thickness image of micro-CT of distal femur in rats of different groups A:CON; B:CTX; C: ALD; D: CoQ10.Compared with control group, trabecular thickness of femur was decreased in CTX group. Both alendronate and CoQ10 drug treatment could improve trabecular thickness compared to CTX group. |
骨生物力学主要是研究骨组织在外界作用下的力学性能和骨在受力后的所产生的生物学效应，是评价药物对骨质量的指标[5]，骨量的减少以及骨质内部结构的改变均能影响骨生物力学，可降低生物 力学强度。另外，micro-CT通过X线扫描和三维重建，极大地解决了骨组织形态计量学测量方面存在切片方向的不固定性和二维平面的局限性的问题，成为研究分析骨微观结构的新兴技术，是理想的研究骨形态学的工具[6]。
由Tab1可知，与CON组比较，CTX组大鼠最大强度、断裂强度、断裂应变及韧性系数明显下降，刚性系数显著增加。最大强度是骨材料所能承受的最大压强，断裂强度是骨材料断裂时所承受的压强，这两个值降低说明CTX使大鼠股骨抗冲击和抗断裂的能力下降。断裂应变反映骨的材料可塑性，韧性系数反映骨材料的韧性，而刚性系数则反映骨材料的脆性，这三个参数受骨矿盐含量和胶原纤维走向等影响；当断裂应变、韧性系数增加，刚性系数降低则说明大鼠股骨的脆性增加，韧性降低。另外，BMD反映松质骨量，Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp分别代表骨小梁的厚度、数量和分离程度，BV/TV反映骨小梁的体积分数，SMI是用于评价骨小梁的形态结构，定义骨小梁板状和杆状的程度，理想板状结构为0，理想杆状结构为3，发生骨质疏松时，骨小梁从板状向杆状转变，SMI数值增加。由Tab2可知，CTX大鼠股骨BMD、Tb.Th、Tb.N、BV/TV明显减小，SMI、Tb.Sp明显增加，表明CTX使大鼠股骨骨量降低，骨小粱形态结构由板状结构转变为杆状结构，骨小梁丢失，其连接逐渐变细、断裂，最后被破坏，甚至消失。CTX大鼠股骨松质骨网状结构的完整性遭到破坏，发生骨折的危险性增加，这与生物力学的参数结果一致，表明松质骨微结构的改变影响了骨承载能力，对生物力学性能产生影响，这与文献报道一致[7, 8]。大鼠股骨干骺端的二维的纵切面截图(Fig1)和三维结构重建图(Fig2)可直接观察骨小梁的结构形态。骨小梁厚度图(Fig3)除了可见骨小梁的结构和几何信息外，还可直接反映骨小梁的厚度分布情况，从绿到红，反映了骨从薄到厚。由上述三种图可见，CTX组大鼠骨小梁变稀疏、数目减少、变细、断裂、间距变宽、形态不规则、网状结构消失、排列不均，呈现出明显的骨微结构破坏，不能保持完整的微观构筑，表明大鼠股骨骨微结构发生了骨质疏松样改变。
ALD是经典的二膦酸盐类抗骨质疏松药物，由Tab2可见，与CTX组相比，ALD组大鼠股骨的各项参数均得到了显著修复，且BMD、BV/TV和Tb.Th较CON组还增加了0.43、0.85和1.02倍，SMI、Tb.Sp则较CON组分别降低了0.48和0.34倍；说明ALD在增加大鼠股骨骨密度，提高骨小梁数量，厚度等方面有着卓越的效果，甚至比CON组大鼠还显著增加，如Fig1和Fig2所示，ALD组大鼠股骨骨小梁数量巨大，排列致密，几乎呈云雾状。而Tab1的结果显示，与CTX组大鼠相比，ALD组大鼠股骨仅断裂应变、韧性系数和刚性系数三参数有明显修复，说明ALD能增加CTX大鼠股骨的韧性，降低骨脆性，但修复抗骨折和抗冲击的效果并不理想，这与其巨大的松质骨量不成正比，但与ALD虽可明显增加骨量，但不能形成良好的排列结构，骨生物力学性能改善有限的报道一致[9, 10]。
CoQ10具有强大的清除自由基作用，在体内有抗氧化和延缓衰老的效果。由Tab2的结果可知，30 mg·kg-1·d-1的CoQ10在修复股骨微观结构中的效果有限，仅能明显增加BV/TV和Tb.Th两个参数，如Fig1和2所示，其骨小梁数量较CTX组有一定改善，但远不如ALD组，而骨小梁的排列却较ALD组更有序。所以，由Tab1可知，CoQ10可明显修复CTX组的所有退变参数，且断裂应变和韧性系数较ALD组也有明显修复，说明虽然CoQ10增加骨量的作用有限，但在改善骨质量，降低骨折风险上却较ALD更佳。
本实验仅研究了30mg·kg-1·d-1的CoQ10在预防CTX大鼠骨质疏松中的作用效果，已表现出了良好的前景，特别是其改善骨质量，增加股骨生物力学性能的作用，更符合目前对抗骨质疏松药物筛选的要求。抗氧化剂在体内极易经氧化而失活，若我们进一步提高CoQ10的剂量或用剂型对其进行保护，或许能得到更佳效果。
| [1] | Balaban R S, Nemoto S, Finkel T, Mitochondria, oxidants, and aging[J].Cell, 2005, 120(4):483-95. |
| [2] | Manolagas S C.From estrogen-centric to aging and oxidative stress:A revised perspective of the pathogenesis of osteoporosis[J].Endocrine Reviews, 2010, 31(3):266-300. |
| [3] | Moon H J, Ko W K, Jung M S, et al.Coenzyme q10 regulates osteoclast and osteoblast differentiation[J].J Food Sci, 2013, 78(5):785-891. |
| [4] | Moon H J, Ko W K, Han S W, et al.Antioxidants, like coenzyme Q10, selenite, and curcumin, inhibited osteoclastdifferentiation by suppressing reactive oxygen species generation[J].Biochem Biophys Res Commun, 2012, 418(2):247-53. |
| [5] | 吴青云, 熊雪婷, 许碧莲, 等.泼尼松对Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠股骨微结构及生物力学的影响[J].中国药理学通报, 2014, 30(7):1018-22. Wu Q Y, Xiong X T, Xu B L, et al.Effecys of prednisone on trabecular microstructure and biomechanical properties of femur in a rat model of type Ⅱ collagen induced arthritis[J].Chin Pharmacol Bull, 2014, 30(7):1018-22. |
| [6] | Kochi G, Sato S, Ebihara H, et al.A comparative study of microfocus CT and histomorphometry in the evaluation of boneaugmentation in rat calvarium[J].J Oral Sci, 2010, 52(2):203-11. |
| [7] | Matsunaga S, Shirakura Y, Ohashi T, et al.Biomechanical role of periimplant cancellous bone architecture[J].Int J Prosthodont, 2010, 23(4):333-8. |
| [8] | Zhang R, Hu S J, L C, et al.Chyranthes bidentata root ectract prevent OVX induced osteporosis in rats[J].J Ethno Pharamacol, 2012, 139(1):12-8. |
| [9] | Ferretti J L, Cointry G R, Capozza R F, et al.Effects of bisphosphonates on the mechanical efficiency of normal and osteopenic bones[J].Med(B Aires), 1997, 57(Suppl 1):83-92. |
| [10] | Hayes W C, Shea M, Rodan G A.Preclinical evidence of normal bone with alendronate[J].Int J Clin Pract Suppl, 1999, 101:9-13. |