2. 延边大学附属医院呼吸内科, 吉林 延吉 133000
2. Dept of Respiratory Medicine, Yanbian University, Yanji Jilin 133000, China
支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞等多种炎症细胞参与的慢性气道炎症性疾病[1]。糖皮质激素是治疗哮喘的一线药物，但长期使用可引起耐药性和严重的副反应。因此，有必要研究哮喘的发病机制，寻求新的治疗哮喘的靶点。芝麻素从芝麻中提取，在体内表现出较强的生物学活性，其药物作用近年逐渐被人们所重视。研究表明，芝麻素通过抑制p38磷酸化和NF-κB激活，抑制IL-6释放[2]，通过p38和JNK信号途径降低MMP-1，3和13的表达[3]，也可以通过降低VCAM-1表达抑制白细胞迁移，改善器官炎症[4]，对血管内皮有明显的保护作用[5]，表明芝麻素有明显的抗炎作用，但芝麻素抗哮喘作用研究却未见报道。本研究利用哮喘动物模型观察芝麻素抗哮喘作用，探讨其作用机制。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂卵清蛋白 (OVA)、氢氧化铝购自美国Sigma公司；细胞因子 IL-4、IL-5、IL-13 和 IFN-γ 检测试剂盒购自美国Invitrogen公司;IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；IκBα、NF-κB p65 和β-actin购自美国Cell Signaling公司。雾化器(上海四菱医疗器械厂402型超声雾化器)；酶联免疫检测仪 (RT-2100C，美国)；电泳仪及电泳槽 (E-C Apparatus Corporation，美国)；Western blot转膜仪和Gel Doc凝胶成像仪(BioRad公司)。
1.2 哮喘模型的建立和动物分组♂ BALB/c 小鼠 40只，体质量(18±5)g，由延边大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(吉)2003-000。小鼠随机分成5组，每组 8 只。正常组(Normal)、哮喘组(OVA)、芝麻素低、高剂量组(Sesamin 50、100 mg·kg-1)、阳性对照地塞米松组(DXM)。除正常组外，其余各组分别于d 1、d 14给小鼠腹腔注射2% OVA和氢氧化铝混合溶液 0.2 mL致敏。d 21将致敏小鼠置于玻璃罩内，以1％ 生理盐水 OVA 溶液15 mL雾化激发 30 min，每天1次，共 5 d。芝麻素低、高剂量组分别在激发前灌服芝麻素50、100 mg·kg-1，地塞米松组按0.5 mg·kg-1灌服地塞米松。共计6 d。
1.3 实验样本获取与处理末次激发 24 h 后处死小鼠，以磷酸盐缓冲液1 mL行支气管肺泡灌洗，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。用细胞计数板计数细胞总数。然后4℃、3 000 r·min-1离心 10 min，取上清液，-80℃ 低温保存，待测细胞因子。沉淀涂片，Diff-Quik染色，高倍镜下进行细胞分类计数。取右肺下叶，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋后切片，进行HE染色。其余各肺叶放入液氮中速冻，-80℃保存。
1.4 BALF中细胞因子IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ含量的检测采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定，具体操作按试剂盒说明书进行，结果单位以pg·L-1表示。
1.5 免疫印迹参照延光海等[6]方法，取 200 mg 肺组织置入裂解液 0.5 mL匀浆，4℃ 12 000×g离心 2 min，取上清液,BCA法测定蛋白浓度，取30 μg蛋白，经12％SDS-PAGE电泳，120 V，90 min，然后电转移至PVDF膜上，在5％脱脂奶粉TBS-T缓冲液(25 mmol·L-1 Tris,150 mmol·L-1 NaCl,1% Tween 20,pH 7.5)室温下封闭2 h，分别加入一抗4℃过夜，洗膜后再用 HRP标记的二抗杂交，37℃ 1 h。洗膜后，在暗室中加ECL发光试剂，显影及定影。杂交信号在图像分析系统中进行光密度扫描。以β-actin 作为内参对照。
1.6 统计学处理 数值用
表示，用SPSS 13.0统计软件，各组计量数据采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用LSD法。
与正常组比较，哮喘组BALF中炎症细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞计数明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；芝麻素高剂量组和地塞米松组明显降低哮喘小鼠BALF中上述细胞数量，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，单核细胞在各组无明显变化(Tab1、Fig1)。
, n=8，×105 ·ml-1)
 |
|
|
Fig 1
Effect of sesamin on total and differential cellular components count in BALF of asthma model mice (，n=8)
#P＜0.05 vs normal; *P＜0.05 vs OVA
|
哮喘组BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平升高，而IFN-γ水平降低，与正常组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)；芝麻素高剂量组和地塞米松组能明显降低哮喘小鼠BALF中细胞因子IL-4、IL-5、IL-13水平，并提高IFN-γ水平，差异均有统计学意义(P＜0.05)(Tab2、Fig2)。
, n=8,pg·L-1)
 |
|
|
Fig 2
Effect of sesamin on levels of IL-4,IL-5,IL-13 and IFN-γ in BALF of asthma model mice (n=8,)
#P＜0.05 vs normal;*P＜0.05 vs OVA
|
HE染色结果显示，正常组气道无明显改变; 模型组气[CM(22]道壁变粗，气道平滑肌增厚，炎症细胞浸润比较明显，多层的炎症细胞围绕在气管和血管周围，黏膜下层增生；芝麻素高剂量组和地塞米松组能明显减轻哮喘病理改变(Fig3)。
|
| Fig 3 Effect of sesamin on pathologic changes in lung tissues of asthma model mice (HE staining, bar=50 μm) |
哮喘组肺组织IL-4、IL-5和IL-13蛋白表达明显增高，但IFN-γ蛋白表达明显降低，与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；芝麻素高剂量组和地塞米松组IL-4、IL-5和IL-13蛋白表达明显降低，但IFN-γ蛋白表达明显升高，与哮喘组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见Fig4。
|
|
Fig 4
Effect of sesamin on protein production of cytokines (IL-4,IL-5,IL-13 and IFN-γ) in lung tissue of asthma model mice (,n=8)
A：Western blot;B：Relative density. #P＜0.05 vs normal；*P＜0.05 vs OVA.
|
哮喘组肺组织的磷酸化IκBα蛋白表达高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.05)；与哮喘组比较，芝麻素高剂量组和地塞米松组磷酸化IκBα蛋白明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，总IκBα蛋白变化与磷酸化刚好相反(Fig5)。表明芝麻素能明显抑制哮喘小鼠IκBα磷酸化和IκBα的降解。
|
|
Fig 5
Effect of sesamin on IκBα phosphorylation in lung tissue of asthma model mice (,n=8)
A：Western blot，B：Relative density.#P＜0.05 vs normal；*P＜0.05 vs OVA.
|
哮喘组细胞核内NF-κB p65明显增加，但胞质中NF-κB p65明显减少，与正常组比较有统计学意义(P＜0.05)。芝麻素高剂量组和地塞米松组细胞核内NF-κB p65减少，而胞质中NF-κB p65明显增加，与模型组比较有统计学意义(P＜0.05)。说明芝麻素有效减少NF-κB核转位，抑制NF-κB活化(Fig6)。
|
|
Fig 6
Effect of sesamin on NF-κB activation in lung tissue of asthma model mice (,n=8)
A：Western blot;B：Relative density. #P＜0.05 vs normal；*P＜0.05 vs OVA.
|
支气管哮喘是一种气道和肺部慢性炎症性疾病，浸润的炎症细胞主要以嗜酸性粒细胞为主，也包括肥大细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等。这些细胞释放多种细胞因子，如Th1细胞因子IFN-γ和Th2细胞因子IL-4、IL-5 和IL-13等，Th1和Th2细胞因子表达的变化直接影响哮喘的发病。研究表明，芝麻素有明显的抗炎作用。芝麻素通过抑制Δ5脂肪酸去饱和酶活性，降低炎症介质前列腺素E2和TNF-α。在LPS诱导的炎症休克小鼠中，芝麻素能明显降低IL-1β、前列腺素E2和血栓素B2水平，提高IL-6和IL-10的表达，从而提高小鼠的存活率[8]。本实验研究显示，芝麻素能明显降低哮喘小鼠BALF中细胞总数和包括嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量；减少哮喘小鼠BALF和肺组织中 IL-4 、IL-5 和IL-13水平，提高IFN-γ的表达；HE染色也显示芝麻素减轻哮喘小鼠肺部炎症细胞浸 润。芝麻素能明显降低Th2代表细胞因子水平，提高Th1代表细胞因子的水平，并能明显抑制哮喘小鼠肺部炎症，提示芝麻素有明显的抗哮喘炎症作用。
哮喘炎症与复杂信号网络转导有关，有关哮喘的发病机制仍然不清楚。NF-κB是一个核转录因子，与包括哮喘等免疫和炎症反应密切相关[9, 10]。正常NF-κB与NF-κB抑制蛋白IκBα结合并稳定的存在于细胞质中，当细胞激活后，IκBα发生磷酸化并降解，NF-κB和IκBα复合体解离，暴露NF-κB核定位序列，NF-κB进入细胞核内与目的基因特异性结合位点结合，促进包括IL-4、IL-5 和IL-13等目的基因的转录。Jeng等[2]研究发现，芝麻素通过抑制p38和NF-κB活化减低BV-2细胞IL-6 mRNA和蛋白的表达。Harikumar等[11]也发现芝麻素通过NF-κB调节KBM-5等多种肿瘤细胞存活、增殖和侵袭。Cui等[12]通过体内和体外实验证明了芝麻素通过ERK1/2和NF-κB信号途径抑制细菌趋化肽诱导的炎症反应，提示NF-κB可能是芝麻素潜在的作用靶点。本实验显示，哮喘小鼠IκBα磷酸化明显增加，总IκBα明显减少，同时细胞质NF-κB p65减少，细胞核内NF-κB p65增多，引起NF-κB核转位。芝麻素能明显抑制IκBα磷酸化，增加总IκBα的表达，同时增加细胞质NF-κB p65，减少细胞核内NF-κB p65，表明芝麻素能够抑制IκBα磷酸化并减少其降解，阻止NF-κB p65与IκBα解离，抑制NF-κB核转位。综上所述，芝麻素有明显的抗哮喘作用，其作用机制部分是通过调节NF-κB激活。
| [1] | Kay A B.Asthma and inflammation[J].J Allergy Clin Immunol, 1991, 87(5):893-910. |
| [2] | Jeng K C, Hou R C, Wang J C, Ping L I.Sesamin inhibits lipopolysaccharide-induced cytokine production by suppression of p38 mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-kappaB[J].Immunol Lett, 2005, 97(1):101-6. |
| [3] | Phitak T, Pothacharoen P, Settakorn J, et al.Chondroprotective and anti-inflammatory effects of sesamin[J].Phytochemistry, 2012, 80(1):77-88. |
| [4] | 周勇, 杨解人.芝麻素对代谢综合征大鼠血糖、血脂及主动脉血管细胞黏附分子-1蛋白表达的影响[J].中国临床药理学与治疗学, 2008, 13(2):195-200. Zhou Y, Yang J R.Effects of sesamin on blood glucose, blood lipids and vascular cell adhesion molecule-1 protein expression of aorta in rats with metabolic syndrome[J].Chin J Clin Pharmacol Ther, 2008, 13(2):195-200. |
| [5] | 郭莉群, 杨解人, 孔祥.芝麻素对2型糖尿病大鼠主动脉内皮功能的保护作用[J].中国药理学通报, 2012, 28(3):392-6. Guo L Q, Yang J R, Kong X.Protective effect of sesamin on endothelial function of type-2 diabetic rats[J].Chin Pharmacol Bull, 2012, 28(3):392-6. |
| [6] | 延光海, 崔云浩, 李光昭, 等.姜黄素抗过敏性作用的实验研究[J].中国药理学通报, 2010, 26(3):416-7. Yan G H, Cui Y H, Li G Z, et al.Anti-allergic effects of curcumin[J].Chin Pharmacol Bull, 2010, 26(3):416-7. |
| [7] | Chavali S R, Zhong W W, Forse R A.Dietary alpha-linolenic acid increases TNF-alpha, and decreases IL-6, IL-10 in response to LPS:effects of sesamin on the delta-5 desaturation of omega6 and omega3 fatty acids in mice[J].Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 1998, 58(3):185-91. |
| [8] | Chavali S R, Zhong W W, Utsunomiya T, Forse R A.Decreased production of interleukin-1-beta, prostaglandin-E2 and thromboxane-B2, and elevated levels of interleukin-6 and-10 are associated with increased survival during endotoxic shock in mice consuming diets enriched with sesame seed oil supplemented with Quil-A saponin[J].Int Arch Allergy Immunol, 1997, 114(2):153-60. |
| [9] | Imanifooladi A A, Yazdani S, Nourani M R.The role of nuclear factor-kappa B in inflammatory lung disease[J].Inflamm Allergy Drug Targets, 2010, 9(3):197-205. |
| [10] | Janssen-Heininger Y M, Poynter M E, Aesif S W, et al.Nuclear factor kappa B, airway epithelium, and asthma:avenues for redox control[J].Proc Am Thorac Soc, 2009, 6(3):249-55. |
| [11] | Harikumar K B, Sung B, Tharakan S T, Pandey M K.Sesamin manifests chemopreventive effects through the suppression of NF-kappa B-regulated cell survival, proliferation, invasion, and angiogenic gene products[J].Mol Cancer Res, 2010, 8(5):751-61. |
| [12] | Cui Y, Hou X, Chen J, et al.Sesamin inhibits bacterial formylpeptide-induced inflammatory responses in a murine air-pouch model and in THP-1 human monocytes[J].J Nutr, 2010, 140(2):377-81. |