气道重塑是支气管哮喘(简称哮喘)发病中的重要环节之一，是难治性哮喘的重要因素，其中气道平滑肌细胞(ASMCs)的增殖发挥了重要作用[1]。罗红霉素(roxithromycin,RXM)是新一代大环内酯类抗生素，经药理研究发现，大环内酯类抗生素除了抗菌作用外，还具有较强的抗炎活性和免疫调节作用[2]。研究发现微囊蛋白-1(caveolin-1)信号通路的激活可能参与气道重构相关的信号转导，抑制哮喘支气管ASMCs [3]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号途径是介导ASMCs增殖的一条重要通路。我们前期研究发现，PI3K/Akt信号途径在哮喘发病中起着重要作用[4]。所以本实验通过建立哮喘模型，使用RXM进行干预，探讨RXM能否抑制TGF-β1刺激导致的哮喘大鼠ASMCs的增殖，并上调caveolin-1表达，抑制p-Akt活化。
1 材料与方法 1.1 实验动物与试剂 1.1.1 实验动物SPF级♂SD大鼠30只(温州医学院实验动物中心提供)，实验动物许可证SYXK(浙)2010-0150，体质量100～120 g,6～8周龄。随机分为对照组和哮喘组(n=15)。
1.1.2 主要试剂优级胎牛血清(杭州四季青公司)，青霉素-链霉素溶液(江苏碧云天生物工程有限公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁生化研究所)，罗红霉素粉剂、SMα-actin单克隆抗体(Sigma公司，美国)，GAPDH抗体、胰酶细胞消化液(江苏碧云天生物工程有限公司)，caveolin-1 抗体、p-Akt抗体(Abcam公司，美国)，RPMI 1640培养基(HyClone公司，美国)。
1.2 方法 1.2.1 哮喘模型的制备复制慢性哮喘模型[5] ,分致敏和激发2阶段。哮喘组分别于d 1和d 8大鼠腹腔注射1 mL OVA/Al(OH)3混合液[内含1 mg OVA和100 mg Al(OH)3]致敏，d 15开始激发，将大鼠置于特制玻璃容器内，雾化吸入含1%OVA的生理盐水8 mL，隔天1次，每次30 min，共8周；对照组用生理盐水代替OVA进行致敏和激发。
1.2.2 肺组织的HE染色大鼠经末次激发后处死，结扎并游离右肺下叶，将其浸入4%的多聚甲醛溶液中，24 h后石蜡包埋，做病理切片。制备好的切片做HE染色，显微镜下观察。
1.2.3 气道平滑肌细胞的培养和鉴定培养正常组和哮喘组大鼠支气管ASMCs，ASMCs细胞通过倒置显微镜形态学观察，并经SMα-actin 抗体,SABC 免疫组化法进行鉴定。采用改良组织贴块法培养原 代ASMCs，加入含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液，置37 ℃、5％CO2孵箱中培养,细胞贴壁生长。加入胰酶细胞消化液进行消化，并采用差速贴壁法纯化细胞，传代细胞用含10％FBS的RPMI 1640培养基培养,按1 ∶ 2～3传代，取第3～6代细胞进行实验。
细胞免疫组化法步骤如下：将ASMCs爬片漂洗固定，0.3%Triton-×100作用20 min，漂洗，3%H2O2孵育后加正常山羊血清，37℃孵育30 min，不洗，滴加小鼠SMα-actin(1 ∶ 200)单克隆抗体，4℃过夜，加生物素化山羊抗小鼠IgG，孵育后加HRP标记链亲和素，再加DAB显色，苏木精复染，脱水，封片后显微镜下观察。
1.2.4 细胞增殖取3~6代细胞，消化、离心后，用含10% FBS的RPMI 1640培养基将细胞调至浓度为4×106~5×106·L-1的混悬液，然后接种于96孔板，每孔100 μL，待细胞80%～90%融合后，换无血清RPMI 1640继续培养24 h，使细胞同步于G0期，换用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养。哮喘组平滑肌细胞分别用TGF-β1、PI3K/Akt通路抑制剂wortmannin、胆固醇剔除剂β-环糊精(β-CD)、RXM进行干预，后3组药物干预后再用TGF-β1刺激，观察平滑肌细胞增殖情况。故细胞随机分为6组：①TGF-β1组、②哮喘组、③正常组、④wortmannin+TGF-β1 组、⑤β-CD+TGF-β1组、⑥RXM+TGF-β1组，其中β-CD作用是破坏caveolae的结构，减少caveolin-1的表达。以上药物所用的终浓度分别为TGF-β1(10 μg·L-1)、wortmannin(10 nmol·L-1)、β-CD(10 mmol·L-1)、罗红霉素(100 mg·L-1)[6, 7]。
用CCK8法检测细胞增殖步骤如下：① 接种细胞于96孔板；② 细胞培养：将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养，培养及分组如上述；③ 显色：培养结束后，每孔加入CCK-8溶液培养2 h；④用酶标仪检测在450 nm处各孔的吸光度。
1.2.5 电镜下观察caveolae的结构取3~8代哮喘模型大鼠ASMCs，经纯化传代，细胞长至达到80％左右密度。取正常组和哮喘组细胞于37℃、5％CO2孵育箱内孵育48 h后,离心,细胞戊二醛固定后，送电镜室进一步处理,观察各组细胞膜表面caveolae变化情况。
1.2.6 Western blot检测大鼠ASMCs中caveolin-1、p-Akt蛋白的表达提取细胞总蛋白，将样本稀释、上样、电泳、转膜后，在5％脱脂奶粉封闭液中封闭2 h后洗膜，分别加兔抗大鼠caveolin-1抗体(1 ∶ 1 000)、p-Akt(1 ∶ 1 000)、Akt(1 ∶ 800)及小鼠抗大鼠GAPDH抗体(1 ∶ 5 000)孵育，4℃冰箱过夜摇床孵育，洗膜；加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(1 ∶ 2 000)及山羊抗小鼠二抗(1 ∶ 3 000)，最后ECL试剂盒显色，扫描、显影、洗像。每组实验均重复3次。
1.2.7 统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计分析。组间差异比较采用单因素方差分析(ANOVA)。
2 结果 2.1 光镜下观察肺组织结构变化光镜显示哮喘组黏膜下、支气管及血管周围大量炎症细胞浸润，气道上皮黏液腺增生，支气管壁明显增厚、管腔狭窄，嗜酸粒细胞增多，见Fig1。
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| Fig 1 Pathology of different groups (×400) A: Control group;B: Asthma group |
① 倒置相差显微镜观察，ASMCs未汇合前多呈梭形或多边形，汇合后部分区域细胞束状排列，起伏状生长，呈典型“峰谷”生长状态。② 免疫细胞化学鉴定：SMα-actin免疫细胞化学染色后，结果显示α-肌动蛋白呈橘黄色丝状物,鉴定为哮喘大鼠ASMCs，见Fig2。
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| Fig 2 Identification of ASMCs A:Immunochemical staining of ASMCs(×200);B: Observation of ASMCs under inverted microscope (×100) |
透射电镜放大12 000倍观察哮喘大鼠ASMCs可见到细胞表面的caveolae结构。正常组caveolae含量丰富，哮喘组caveolae结构破坏。见Fig3。
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| Fig 3 Observation of caveolae in ASMCs by scanning electron microscope (×7000) A: Control group;B:Asthma group. |
TGF-β1组与正常组、哮喘组比较,OD值均明显增加(P＜0.01, P＜0.05)；与TGF-β1组相比，RXM+TGF-β1组OD值下降(P＜0.05)，见Tab1。
, n=16)
p-Akt蛋白的表达在哮喘组增加，TGF-β1组较哮喘组p-Akt表达量明显增加，而用抑制剂wortmannin后p-Akt的活化明显降低，罗红霉素可以明显抑制p-Akt的活化。Caveolin-1在哮喘组和TGF-β1组表达量较正常组降低，经β-CD干预后表达明显降低，经罗红霉素干预后较TGF-β1组表达量增高，两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见Fig4。
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| Fig 4 Expressions of caveolin-1 and p-Akt in ASMCs by Western blot A:TGF-β1 group；B:Asthma group；C: Normal group；D: Wortmannin+TGF-β1 group；E: β-CD+TGF-β1 group； F: RXM+TGF-β1 group.*P＜0.05 vs TGF-β1 group |
研究表明大环内酯类抗生素除了具有抑制炎症、控制免疫反应等作用外，还能抑制ASMCs的增殖，从而调控气道重塑的发生[8]。本课题组前期的实验结果已表明，在光镜下哮喘组与正常组大鼠支气管基底膜周径差异无统计学意义，管壁总面积、平滑肌面积具有可比性。哮喘组管壁厚度(μm2/ μm)、平滑肌厚度(μm2/μm)均明显高于对照组，差异有统计学意义[9]。本研究哮喘组ASMCs加用RXM干预后增殖明显减少，提示RXM可能存在抑制ASMCs增殖的作用，那这种作用是通过何种途径实现的呢？
Caveolin-1可以减少气道ASMCs的生长、负性调节气道平滑肌增殖[10]。TGF-β1 被认为是致气道重塑的主要介质，它通过调节ASMCs迁移及增生等多种途径参与哮喘的发病过程[11]。本实验发现，用TGF-β1刺激哮喘ASMCs增殖的过程中，caveolin-1的表达量明显减少，故进一步推测caveolin-1可能在TGF-β1诱导哮喘ASMCs增殖的过程中起着负性调控作用。在本研究中哮喘组ASMCs中加入β-CD破坏caveolae的结构，减少caveolin-1的表达，再用TGF-β1刺激，发现ASMCs增殖明显增加，证实了caveolin-1在TGF-β1诱导哮喘ASMCs增殖的过程中发挥了负性调控的作用。在RXM干预组发现caveolin-1表达明显增加，ASMCs增殖减少，推测罗红霉素能抑制ASMCs的增殖，可能与上调caveolin-1的表达有关。
Park等[12]实验中发现，细胞膜上的caveolin-1的活化可激活PI3K/Akt 通路,而且有研究发现敲除caveolin-1基因可减少TGF-β介导的Akt的磷酸化[13]。本实验发现TGF-β1组ASMCs增殖的过程中，p-Akt的表达量增加，用β-CD干预破坏caveolin-1后，p-Akt表达量较TGF-β1组增加更为明显，ASMCs的增殖也更为明显，RXM干预后，p-Akt表达量下降，ASMCs增殖减少。所以本研究提示RXM减少ASMCs增殖可能与上调caveolin-1，抑制p-Akt活化有关。
此外caveolae作为信号转导中心可能调控较多的信号通路，它们之间是否存在交叉对话，共同调控ASMCs增殖，这些将有待我们进一步的研究。
总之，RXM可能抑制TGF-β1刺激导致的哮喘大鼠ASMCs的增殖，并上调caveolin-1表达，抑制p-Akt活化。本实验从动物实验方面对RXM调控ASMCs增殖的机制进行了探索，为哮喘的防治提供了新策略、开辟了新途径。
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