2. 省部共建新疆特种资源植物药重点实验室, 新疆 石河子 832002;
3. 石河子大学生命科学学院, 新疆 石河子 832002
2. Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources, Ministry of Education, Shihezi University, Shihezi Xinjiang 832002, China;
3. School of Life Scisences, Shihezi University, Shihezi Xinjiang 832002, China
viniferin是葡萄等植物产生的一类以二苯乙烯骨架为主的多酚产物，因在抵抗病菌侵染时承担重要保护作用又称为葡萄抗毒素[1]。这类产物近年来被证明具有很好的抗氧化、心血管保护及抑制肿瘤血管新生等活性[2]。α-维尼非林(α-viniferin，Fig1)作为其中的典型代表被证实对白血病(leukemia)细胞的敏感程度较高[3]。但国内鲜有研究报道α- viniferin对白血病的药理作用。因此本研究拟以慢性髓系白血病K562细胞为模型，研究α-viniferin对K562细胞促凋亡作用与相关机制。
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| Fig 1 Inhibitory rate of α-viniferin on K562 cells after |
人慢性髓系白血病K562细胞购自中国科学院上海细胞库；α-viniferin购自云南西力生物技术有限公司。RPMI 1640细胞培养基购自美国Gibco公司；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。Giemsa染料、二甲基亚砜(DMSO)、吖啶橙(AO)、溴化乙锭(EB)购自美国Sigma公司；Hoechst 33258染料购自北京索莱宝科技有限公司；细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；caspase-3、caspase-9荧光定量检测试剂盒购自美国Biovision公司；UNIQ-10柱式TRIzol总RNA提取试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；cDNA逆转录试剂盒购自TaKaRa公司。
1.2 主要仪器CO2细胞培养箱(Thermo Forma，美国Thermo公司)；Centrifuge 5430R、5424低温离心机(德国Eppendorf公司)；Obsever A1倒置荧光显微镜(德国ZEISS公司)；Varioskan Flash 3001多功能酶标仪(美国Thermo公司)；PCR仪(德国Eppendorf公司)、UVP凝胶成像系统 (美国Spring公司)。
1.3 细胞培养K562 细胞采用含10%的新生牛血清 RPMI 1640，青霉素(100 kU·L-1) 和链霉素(50 mg·L-1)，在 37 ℃、5% 的CO2孵育箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
1.4 α-viniferin对 K562 细胞增殖的抑制作用96孔培养板上每孔接种1×104个细胞，培养液体积为200 μL，实验组分别加入不同浓度(0、0.5、2、8、32、128 mg·L-1)的α-viniferin，对照组不加药，每组设 6 个复孔，37 ℃分别培养12、24、48 h，每孔加入 5 g·L-1 的MTT溶液20 μl，继续培养4 h，800×g离心5 min 弃上清，加入DMSO 150 μl，振荡10 min，酶标仪检测490 nm 处的吸光度(OD)值，并绘制相应的抑制率-浓度曲线[4]。
1.5 细胞凋亡检测6孔培养板上每孔种植 5×105个细胞，体积为3 ml，实验组加32 mg·L-1的α-viniferin，对照组不加药，37 ℃分别培养24 h，800×g离心5 min 弃上清收集细胞，分别用Hoechst 33258[5]、Giemsa[6]、AO/EB法染色[7]，可见光、荧光观察拍照。
1.6 细胞凋亡线粒体膜电位检测不同浓度(0、2、8、32 mg·L-1)α-viniferin处理细胞24 h，收集细胞，取 500 μL JC-1工作液将细胞均匀悬浮，37 ℃，5% CO2的培养箱中孵育 15~20 min；室温离心(300×g，5 min)，收集细胞，用1×孵育缓冲液洗2次；吸取500 μL 1×孵育缓冲液重新悬浮细胞；酶标仪对其进行荧光检测：激发光:488 nm，发射光:530 nm。
1.7 caspase-3、caspase-9活性检测药物诱导细胞凋亡。收集2×106个细胞。转移细胞到冷冻的50 μL cell lysis Buffer中，冰上孵育细胞10 min。每个样品加入50 μL的2 × Reaction Buffer(含10 mmol·L-1 DTT)，加5 μL 1 mmol·L-1 LEVD-AFC底物(终浓度为50 μmol·L-1)。37 ℃孵育2 h。将样品转移至96孔板中，荧光检测：激发光:400 nm;发射光:505 nm。
1.8 α-viniferin对K562细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响分别使用 α-viniferin (0、2、8、32 mg·L-1)处理24 h。本实验使用相对定量 RT-PCR方法来检测细胞凋亡相关分子Bad、Bid、Bim、Bax、Bcl-2、Bcl-xL的表达变化。使用 UNIQ-10柱式TRIzol总RNA提取试剂盒提取总 RNA，检测定量RNA水平及含量，并用cDNA反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。PCR 扩增条件为: 热启动，起始温度 94 ℃，3 min; 变性 94 ℃，30 s; 复性 58 ℃，30 s; 延伸 72℃，45 s；扩增循环数40。PCR 产物经琼脂糖凝胶(2%) 电泳后，使用核酸染料染色，凝胶成像系统拍照分析。引物序列及退火温度见Tab1。
所有实验重复3次，采用SPSS 19.0统计软件分析，实验结果以
表示，各组间比较采用单因素方差分析及Dunnett法检验。
α-viniferin对K562细胞的抑制作用随作用浓度与时间增加而增强。如Fig2 所示呈现一定的时效与量效关系。浓度小于8 mg·L-1时α-viniferin对K562细胞的抑制率较低，大于此浓度时抑制率呈快速上升趋势。24 h半数抑制浓度(IC50)为13.61、128 mg·L-1 处理48 h细胞几乎全部死亡(抑制率为97.07%)。根据这些结果，后续实验选择药物浓度32 mg·L-1、处理时间为24 h进行研究。
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Fig 2
Inhibitory rate of α-viniferin on K562 cells after treatment of 12，24 and 48 h (, n=3)
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普通光镜下观察正常对照组K562细胞呈规则圆形、透明、折光性好，边界清晰光滑整齐，细胞大小均一(Fig3A、3E)。α-viniferin(32 mg·L-1)处理24 h后，K562细胞破裂且呈大小不均一的囊泡化特殊结构，折光性降低，边界模糊不完整，细胞出现明显凋亡形态(Fig3B)。细胞核DNA经Hoechst 33258荧光试剂染色后，空白对照组细胞核形态规则，呈弥散均匀的圆形荧光(Fig3C)。药物处理组则出现浓染致密的颗粒块状荧光，此现象则表现了凋亡所特有的核固缩、染色质高度凝聚和碎裂不均一化形态(Fig3D)。通过Giemsa染色可以看出药物处理组细胞边界不规则出现凋亡小泡(Fig3F)。经AO/EB双染可以看出α-viniferin处理K562细胞后出现早期凋亡和晚期凋亡，但未发现细胞坏死现象(Fig3F、3H)。
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| Fig 3 Cellular morphological characteristic changes of K562 cells treated by α-viniferin (400×) A、C、E、G：K562 cells without α-viniferin treatments; B、D、F、H：K562 cells treated with 32 mg·L-1 α-viniferin for 24 h. |
α-viniferin引起K562细胞线粒体膜电势下降呈药物浓度依赖性变化(Fig4)。在α-viniferin浓度由2 mg·L-1至32 mg·L-1增加过程中，通过JC-1染色荧光强度检测，随药物浓度增加红色荧光逐渐减弱，绿色荧光逐渐增强，细胞内绿色/红色荧光强度比升高，表明该部分线粒体膜电势降低，并呈现浓度依赖关系。
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Fig 4
Cell mitochondrial membrane potential changes (, n=3)
**P＜0.01 vs control
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如Fig5所示，正常对照组caspase-3、caspase-9活性较低，随着药物浓度增加细胞内caspase-3、caspase-9活性不断增加。caspase-9活性在2~8 mg·L-1时略有升高，在32 mg·L-1时活性明显高于其它给药组。而caspase-3的活性随着药物浓度增加而明显升高。
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Fig 5
Analysis of cell caspase-3 and caspase-9 activity in response to K562 cells (, n=3)
*P＜0.05，**P＜0.01 vs control
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如Fig6所示，不同药物浓度处理K562细胞后，细胞内caspase-3的表达量较空白对照组明显增加，这与Fig5中caspase-3活性随浓度升高而升高的现象相一致。Bcl-2家族中的 促凋亡基因Bad、Bid、Bim、Bax表达量均相对于空白对照组有所增加，其中Bax在32 mg·L-1处理后表达量显著增加。抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL的表达量相对于对照组明显下降。
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| Fig 6 Expression of apoptosis-related mRNA in different groups detected by semi-quantitative RT-PCR |
慢性粒细胞白血病K562细胞是一种危害性较大的恶性肿瘤细胞，其恶性表型为恶性克隆增殖性。化疗药物诱导K562细胞凋亡已经成为主要作用机制。
Sui等[10]研究报道，白藜芦醇对K562细胞的24 h半数抑制浓度为9 mg·L-1，而本实验研究发现α-viniferin作用K562细胞24 h后，IC50为13.61 mg·L-1。由此可见，在结构上α-viniferin虽为白藜芦醇的三聚体，但在药效学上，并不是白藜芦醇作用的简单叠加关系。由于结构不同α-viniferin很可能作用在细胞其他靶点而发挥其药效学作用。
体外实验研究证明，白藜芦醇可通过Fas/FasL途径[11]、Bcl-2家族蛋白[12]诱导caspase-3激活而引起K562细胞凋亡。在诱导凋亡过程中，白藜芦醇可下调Bcl-2，上调Bax，激活caspase-3。α-viniferin作为白藜芦醇的三聚体，国内外鲜有文献报道其对血系肿瘤细胞的影响，对于线粒体途径引起肿瘤细胞凋亡更是无文献报道。因此本文研究不同浓度的α-viniferin处理K562细胞24 h后，发现增殖抑制，形态学观察可见早期和晚期凋亡，但未发现细胞坏死现象。核固缩、染色质高度凝聚和碎裂，并伴有凋亡小体出现，为典型细胞凋亡现象。同时发现caspase-3 mRNA表达水平升高，凋亡相关基因Bax表达显著增强，Bcl-2表达下降。这些结果与白藜芦醇诱导肿瘤细胞凋亡现象相似。进一步证明α-viniferin可诱导K562细胞凋亡。Bax、Bcl-2是线粒体凋亡途径的重要调节分子。外界刺激因素引起细胞线粒体膜通透性改变，Bcl-2、Bcl-xL等下调，Bax、Bid、Bim、Bad等基因上调，进而使caspase家族出现凋亡级联反应，导致细胞发生凋亡反应[13]。本文发现，α-viniferin引起线粒体凋亡途径的关键蛋白酶caspase-9活性升高，线粒体膜通透性改变。上述研究结果表明，α-viniferin可通过线粒体凋亡途径诱导K562细胞凋亡。
综上所述，α-viniferin能抑制K562细胞增殖，并通过激活线粒体凋亡途径导致细胞凋亡。本研究指出了α-viniferin对K562细胞的致死类别与原因，对于这类化合物对白血病细胞的特殊敏感性，以及α-viniferin对白血病细胞的特异性方面仍需更多的证据。
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